【摘要】：研究背景糖尿病下肢血管病變(lower extremity peripheral arterial disease in diabetes, Diabetic LEAD)是糖尿病患者常見(jiàn)的慢性血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致糖尿病患者足部潰瘍乃至下肢截肢的主要原因。球囊擴(kuò)張術(shù)即經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)由于療效確切、創(chuàng)傷小且術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為糖尿病下肢血管病變的主要治療措施。但PTA后擴(kuò)張部位再狹窄(restenosis,RS)的發(fā)生,嚴(yán)重影響著患者的遠(yuǎn)期療效及預(yù)后,限制了該項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用。為預(yù)防和改善再狹窄,較大血管可以考慮采用血管內(nèi)支架植入術(shù),但糖尿病下肢血管病變范圍主要集中在膝以下脛腓動(dòng)脈和其分支,不適合應(yīng)用支架,這致使PTA在糖尿病下肢血管病變治療中作用更加凸顯。解決PTA后再狹窄問(wèn)題是提高糖尿病下肢血管病變療效的關(guān)鍵,探究再狹窄發(fā)生發(fā)展機(jī)制,對(duì)今后糖尿病下肢血管病變的治療尤為重要。由于人體中再狹窄血管組織不易獲得,對(duì)于再狹窄的研究主要依賴(lài)于體外細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。體外研究難以充分說(shuō)明再狹窄病變的機(jī)制,而目前體內(nèi)的再狹窄研究也存在難點(diǎn)：多數(shù)研究者采用單次球囊拉傷術(shù)構(gòu)建動(dòng)物模型進(jìn)行再狹窄相關(guān)研究,但此模型存在不足,其建立的“再狹窄”病變形成機(jī)制與人體PTA后再狹窄有差異,不能很好的模擬人體再狹窄過(guò)程。缺少理想的動(dòng)物模型使再狹窄的相關(guān)研究頗具爭(zhēng)議性,研究之間缺乏可比性且進(jìn)展緩慢,建立與人下肢血管病變PTA后再狹窄過(guò)程相似的動(dòng)物模型,對(duì)再狹窄發(fā)生機(jī)制及預(yù)防的研究尤為重要。本研究擬模擬人下肢血管病變PTA后血管損傷過(guò)程,對(duì)具有動(dòng)脈粥樣硬化病變的血管行PTA手術(shù),以此方式建立與人下肢血管病變PTA后再狹窄相似的動(dòng)物模型；同時(shí)將采用球囊拉傷術(shù)構(gòu)建的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型作為對(duì)照,并設(shè)定不同血糖分組對(duì)上述再狹窄與動(dòng)脈粥樣硬化血管斑塊進(jìn)行對(duì)比研究,以便于探索再狹窄與動(dòng)脈粥樣硬化的差異及高血糖狀態(tài)對(duì)再狹窄的影響,更好的探究再狹窄發(fā)生機(jī)制。研究目的1、建立與人下肢血管病變PTA后再狹窄發(fā)病機(jī)制相似的動(dòng)物模型；2、同時(shí)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄動(dòng)物模型,并通過(guò)設(shè)定不同血糖分組對(duì)兩者血管斑塊行對(duì)比研究,以探索動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄發(fā)病機(jī)制的差異及高血糖狀態(tài)對(duì)再狹窄的影響,更好的探究再狹窄發(fā)生機(jī)制。研究方法1、實(shí)驗(yàn)分組及模型建立：(1)糖尿病再狹窄vs.非糖尿病再狹窄；(2)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化vs.非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化。選取3月齡新西蘭大耳白兔(～1.7kg),使用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,再進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)兔分為4組：①糖尿病再狹窄組：a.四氧嘧啶80mg/kg于耳緣靜脈注射以建立1型糖尿病模型(實(shí)驗(yàn)第1周),b.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型(實(shí)驗(yàn)第2周),c.超聲檢測(cè)球囊拉傷部位,觀察拉傷部位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況(手術(shù)結(jié)束4周,實(shí)驗(yàn)第6周),d.對(duì)髂動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成部位行PTA手術(shù)(實(shí)驗(yàn)第6周),建立再狹窄模型；②非糖尿病再狹窄組：a.生理鹽水于耳緣靜脈注射(實(shí)驗(yàn)第1周),b.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型(實(shí)驗(yàn)第2周),c.超聲檢測(cè)球囊拉傷部位,觀察拉傷部位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況(手術(shù)結(jié)束4周,實(shí)驗(yàn)第6周),d.對(duì)髂動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成部位行PTA手術(shù)(實(shí)驗(yàn)第6周),建立再狹窄模型；③糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組：a.四氧嘧啶80mg/kg于耳緣靜脈注射建立1型糖尿病模型(實(shí)驗(yàn)第1周),b.超聲檢測(cè)髂動(dòng)脈血管通暢狀況(實(shí)驗(yàn)第6周),c.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型(實(shí)驗(yàn)第6周)；④非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組：a.生理鹽水于耳緣靜脈注射(實(shí)驗(yàn)第1周),b.超聲檢測(cè)髂動(dòng)脈血管通暢狀況(實(shí)驗(yàn)第6周),c.球囊拉傷術(shù)建立髂動(dòng)脈粥樣硬化模型(實(shí)驗(yàn)第6周)。2、糖化血紅蛋白檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束留取動(dòng)物血樣標(biāo)本測(cè)定糖化血紅蛋白。3、標(biāo)本獲取及病理學(xué)檢測(cè)：再狹窄及動(dòng)脈粥樣硬化模型建立后觀察28天,對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死,建模部位血管取材,10%中性甲醛固定,脫水、石蠟包埋后切片。①HE染色觀察血管大體形態(tài),② Masson染色觀察平滑肌及膠原,③EVG染色觀察彈力纖維。應(yīng)用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量建模部位血管斑塊的內(nèi)膜厚度、中膜厚度、血管總面積,內(nèi)膜及中膜面積等指標(biāo),并計(jì)算狹窄率、內(nèi)膜／中膜比值。應(yīng)用增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、α-actin及CD68抗體,分別對(duì)建模部位血管斑塊內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)目、平滑肌細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞含量進(jìn)行測(cè)定。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用mean±SD表示,使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè)),P0.01被認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè))。研究結(jié)果1、動(dòng)物一般情況各組實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)血糖基線(xiàn)水平一致。糖尿病組實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射四氧嘧啶1周后,糖尿病模型成功率～66.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,2只糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔及1只糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔死于高血糖；2只非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔及1只非糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔死于超聲檢查；1只非糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔及2只糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔死于血栓。2、各組實(shí)驗(yàn)兔體重及血糖情況各組實(shí)驗(yàn)兔體重在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)及結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)水平大致相同,均無(wú)明顯差異(P0.05)。建模前各組實(shí)驗(yàn)兔之間血糖水平無(wú)差異,四氧嘧啶注射1周后糖尿病組實(shí)驗(yàn)兔整體血糖水平升高,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均明顯高于非糖尿病組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；相同血糖類(lèi)型模型下的實(shí)驗(yàn)兔血糖之間無(wú)差異(糖尿病再狹窄組vs.糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組,P0.05；非糖尿病再狹窄組與非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組,P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔糖化血紅蛋白進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果同各組血糖所反映的狀況一致。3、超聲檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)第6周對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔髂動(dòng)脈部位行超聲檢測(cè),糖尿病及非糖尿病再狹窄組全部實(shí)驗(yàn)兔髂動(dòng)脈球囊拉傷部位均可見(jiàn)低回聲斑塊；糖尿病及非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔相應(yīng)部位血管內(nèi)膜光滑,腔內(nèi)未見(jiàn)異�；芈�,提示血管無(wú)狹窄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前(第10周),超聲檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔建模部位血管,均可見(jiàn)斑塊形成。4、各組建模部位血管狹窄率及內(nèi)膜／中膜面積結(jié)果各組實(shí)驗(yàn)兔髂動(dòng)脈建模部位均可見(jiàn)斑塊形成。其中,糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組血管狹窄率明顯高于非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組(P0.05)；然而,糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔建模部位血管狹窄率與非糖尿病再狹窄組之間卻未見(jiàn)明顯差異(P0.05),兩組實(shí)驗(yàn)兔髂動(dòng)脈建模部位均嚴(yán)重狹窄。再狹窄組建模部位血管中膜較動(dòng)脈粥樣硬化組薄,其中中膜層最薄的為糖尿病再狹窄組,中膜層最厚的為非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組。兩再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔建模部位血管內(nèi)膜／中膜面積之間無(wú)差異(糖尿病再狹窄組vs.非糖尿病再狹窄組,P0.05)；兩動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔建模部位血管內(nèi)膜／中膜面積之間有差異(糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組vs.非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組,P0.05)。5、斑塊組成成分及細(xì)胞增殖狀況結(jié)果特殊染色結(jié)果顯示：再狹窄血管內(nèi)彈力纖維斷裂,中膜內(nèi)有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜成分嵌入；血管斑塊大部分表現(xiàn)為典型的圓形及向心性損傷,也有少數(shù)為非典型形狀損傷；新生的內(nèi)膜中少見(jiàn)泡沫細(xì)胞。兩動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔血管斑塊成分和特征與他人相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。Masson、α-actin及CD68免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：糖尿病再狹窄組及非糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔髂動(dòng)脈斑塊處滿(mǎn)布平滑肌細(xì)胞,巨噬細(xì)胞含量低,兩組之間差異不明顯；兩動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔血管斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞較少見(jiàn),但巨噬細(xì)胞含量高,其中糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量升高明顯,高于非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組。PCNA檢測(cè)細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示：糖尿病再狹窄組及非糖尿病再狹窄組斑塊內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯增高,兩組之間無(wú)明顯差異(P0.05)；再狹窄組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率比動(dòng)脈粥樣硬化組高；糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組斑塊內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率高于非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組(P0.05)。研究結(jié)論1、本研究通過(guò)模擬人下肢血管病變PTA后血管損傷過(guò)程,對(duì)具有動(dòng)脈粥樣硬化病變的血管行PTA手術(shù),成功建立與人下肢血管病變PTA后再狹窄相似的理想動(dòng)物模型。2、高糖雖是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素,對(duì)再狹窄的發(fā)生、發(fā)展卻影響不大,造成這種差異的主要原因可能是動(dòng)脈粥樣硬化與再狹窄發(fā)生機(jī)制的不同。3、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要為炎性病變引起,而再狹窄斑塊形成機(jī)制主要是血管平滑肌細(xì)胞從中膜遷移到內(nèi)膜并劇烈增殖,對(duì)再狹窄血管中平滑肌細(xì)胞遷移增殖的研究是防治PTA后再狹窄的重點(diǎn)。研究背景再狹窄(Restenosis，RS)嚴(yán)重影響著糖尿病下肢血管病變(lower extremity peripheral arterial disease in diabetes，Diabetic LEAD)患者經(jīng)球囊擴(kuò)張術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)治療后的遠(yuǎn)期效果，探究影響再狹窄病變的因素對(duì)糖尿病下肢血管病變PTA治療尤為重要。降糖藥物是糖尿病患者常規(guī)治療措施，然而臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者所使用的降糖藥物影響再狹窄發(fā)生率�；请孱�(lèi)藥物(Sulfonylureas，SUs)是臨床常用口服降糖藥物之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)現(xiàn)約有70%的糖尿病患者采用SUs治療。有研究發(fā)現(xiàn)SUs與再狹窄發(fā)生有關(guān)，但具體機(jī)制不明，有關(guān)研究較少。眾所周知，SUs在體內(nèi)主要通過(guò)促進(jìn)胰腺胰島素分泌以降低血糖，其機(jī)制是結(jié)合胰島β細(xì)胞膜表面ATP敏感性鉀(ATP-sensitive potassium，KATP)通道的磺脲類(lèi)受體1(sulfonylurea receptorl，SUR1)，關(guān)閉KATP通道。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)SUs還具有胰腺外作用，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，磺脲類(lèi)受體(SUR)不僅存在于胰島β細(xì)胞，還廣泛分布于心臟(SUR2A)及血管平滑(SUR2B)等部位，而SUs可以結(jié)合胰腺外組織器官的SUR，調(diào)控相應(yīng)部位KATP通道。目前已有研究顯示胰腺外組織KATP通道開(kāi)關(guān)狀態(tài)可影響細(xì)胞功能及代謝等生理病理過(guò)程。我們的前期研究結(jié)果(I部分)與其他相關(guān)研究達(dá)成一致共識(shí)：再狹窄主要是由血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)大量遷移增殖造成的，VSMCs遷移增殖調(diào)控是PTA介入治療后再狹窄研究的關(guān)鍵。SUs通過(guò)結(jié)合SURs關(guān)閉KArp通道起作用，而SURs中SUR2B亞型在VSMCs中廣泛表達(dá)。因此，SUs是否可通過(guò)結(jié)合VSMCs上SUR2B關(guān)閉細(xì)胞KATP通道，調(diào)控VSMCs的遷移增殖?目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中，我們擬首先于體外培養(yǎng)VSMCs，采用不同SUs對(duì)其處理，觀察不同SUs對(duì)VSMCs遷移增殖的影響；并對(duì)處理后VSMCs上KATP通道開(kāi)關(guān)狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控，探究SUs是否可通過(guò)胰腺外關(guān)閉KATP通道作用，影響VSMCs的遷移增殖，并探究不同SUs對(duì)VSMCs遷移增殖調(diào)控機(jī)制；最后分析不同SUs對(duì)VSMCs調(diào)控作用在其再狹窄影響中的角色。研究目的1、在體外細(xì)胞水平，研究不同SUs對(duì)VSMCs增殖及遷移能力的影響。2、探究不同SUs對(duì)VSMCs遷移增殖調(diào)控機(jī)制。3、分析SUs對(duì)VSMCs遷移增殖調(diào)控作用在其對(duì)再狹窄影響中的角色。研究方法1、人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)培養(yǎng)及分組：HA-VSMC細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，取第4-6代應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：①Control組；②格列美脲組；③格列本脲組；④格列齊特組。2、免疫熒光方法檢測(cè)HA-VSMC細(xì)胞株SUR2表達(dá)采用細(xì)胞免疫熒光法，檢測(cè)HA-VSMC膜表面SUR2的表達(dá)。3、SUs藥物劑量選取分別測(cè)定3種SUs(格列美脲、格列本脲及格列齊特)對(duì)HA-VSMC活力的影響，計(jì)算并選擇3種SUs對(duì)HA-VSMC同等活力影響的藥物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。4、細(xì)胞增殖及遷移能力檢測(cè)①對(duì)體外培養(yǎng)的HA-VSMC經(jīng)空白、格列美脲、格列本脲、格列齊特處理24小時(shí)，利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒對(duì)各組HA-VSMC增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，明確3種SUs對(duì)HA-VSMC增殖的影響。②空白、格列美脲、格列本脲及格列齊特干預(yù)體外培養(yǎng)的HA-VSMC 24小時(shí)，利用Transwell小室對(duì)各組細(xì)胞遷移能力進(jìn)行檢測(cè)。明確3種SUs對(duì)HA-VSMC遷移的影響。③為進(jìn)一步研究，再分別于各實(shí)驗(yàn)組中加入100μM二氮嗪(KATP通道開(kāi)放劑)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)開(kāi)放KATP通道后，格列美脲、格列本脲及格列齊特對(duì)體外培養(yǎng)的HA-VSMC遷移增殖能力的影響。5、免疫印跡分析(western blot)提取蛋白，利用western blot檢測(cè)p-NF-κ3-p65表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析全部數(shù)據(jù)用mean±SE表示，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè))，P0.01被認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè))。研究結(jié)果1、免疫熒光方法對(duì)HA-VSMC細(xì)胞株SUR2表達(dá)檢測(cè)：HA-VSMC細(xì)胞表面有豐富的SUR2表達(dá)。2、SUs藥物劑量選取結(jié)果對(duì)格列美脲、格列本脲及格列齊特處理的HA-VSMC活力進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算其抑制率，取ICl0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：格列美脲濃度為208~tM、格列本脲21μM、格列齊特2000μM。3、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果采用上述選定的藥物濃度檢測(cè)格列美脲、格列本脲及格列齊特對(duì)VSMCs增殖影響，與對(duì)照組相比，格列美脲及格列本脲組HA-VSMC細(xì)胞增殖增多，促增殖；格列齊特組則HA-VSMC細(xì)胞增殖減少，抑增殖。加入二氮嗪后，格列美脲及格列本脲由之前的促進(jìn)HA-VSMC增殖轉(zhuǎn)變?yōu)橐衷鲋�，分別計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為：格列美脲組(12.36±1.15)%，格列本脲組(5.96±0.58)%，格列齊特組(17.49±0.1)%，與對(duì)照組相比均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)，同時(shí)將三種SUs對(duì)HA-VSMC增殖影響結(jié)果兩兩比較發(fā)現(xiàn)，各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果Transwell小室結(jié)果顯示：格列美脲、格列本脲組HA-VSMC遷移數(shù)目增多(格列美脲：vs.對(duì)照組，P0.05；格列本脲：vs.對(duì)照組，P0.01)，，促HA-VSMC遷移；格列齊特則抑制HA-VSMC遷移，計(jì)數(shù)HA-VSMC遷移數(shù)目減少(vs.對(duì)照組，P0.05)。加入二氮嗪后，格列美脲及格列本脲組HA-VSMC遷移細(xì)胞數(shù)目減少，低于對(duì)照組，由促HA-VSMC遷移變?yōu)橐种破溥w移作用。5、格列齊特通過(guò)NF-κB通路調(diào)控VSMCs生物學(xué)功能NF-κ3信號(hào)通路在再狹窄VSMCs遷移增殖調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，我們通過(guò)western blot對(duì)磷酸化NF-κ3亞基p65(p-NF-κB-p65)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，經(jīng)格列齊特處理的HA-VSMC，p-NF-κB-p65表達(dá)降低，加入PMA(濃度1μM，激活NF-rd3通路)后，可拮抗格列齊特對(duì)HA-VSMC遷移及增殖的抑制作用。研究結(jié)論1、不同SUs對(duì)VSMCs遷移增殖的影響不同，在本實(shí)驗(yàn)所選取的常用SUs中，格列本脲和格列美脲對(duì)VSMCs的遷移及增殖起到促進(jìn)的作用，格列本脲的促進(jìn)作用更為顯著，格列美脲次之，KATP通道開(kāi)關(guān)狀態(tài)在其中扮演著重要角色。2、格列齊特對(duì)VSMCs遷移增殖表現(xiàn)為抑制作用，機(jī)制可能與其SUR選擇性，及在VSMCs上調(diào)控NF-κB通路的活性相關(guān)。研究背景磺脲類(lèi)藥物(Sulfonylureas，SUs)是2型糖尿病治療中最常用的口服降糖藥物之一，是胰島素促泌劑的一種，其通過(guò)作用于胰島β細(xì)胞表面的磺脲類(lèi)受體1(sulfonylurea receptorl，SUR1)，促胰島素分泌，發(fā)揮降低血糖的作用。目前有研究顯示，除胰腺胰島β細(xì)胞外，SUs還可以作用于體內(nèi)多個(gè)器官靶點(diǎn)，影響多個(gè)生理病理過(guò)程，具有胰腺外作用，其中胰腺外降糖作用是研究熱點(diǎn)之一。SUs可通過(guò)此作用實(shí)現(xiàn)對(duì)血糖的進(jìn)一步調(diào)控，因此，雖然指南強(qiáng)調(diào)在起始胰島素強(qiáng)化治療方案時(shí)要停用SUs，但仍然有不少醫(yī)生將胰島素強(qiáng)化治療和SUs聯(lián)合應(yīng)用。然而，目前有關(guān)SUs胰腺外降糖作用的證據(jù)多是體外研究，體內(nèi)研究中未能排除/未考慮SUs促胰島B細(xì)胞分泌胰島素的影響。有實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用生長(zhǎng)抑素抑制亦或是應(yīng)用具有高胰島素血癥的KK鼠弱化SUs介導(dǎo)的胰島素分泌，對(duì)SUs的胰腺外降糖作用進(jìn)行體內(nèi)研究及證實(shí)，但上述方法均不能實(shí)現(xiàn)對(duì)SUs促胰島素分泌作用的完全阻斷，無(wú)法明確證實(shí)體內(nèi)SUs胰腺外降糖作用的存在。因此，所謂的SUs“胰腺外降糖作用”是由未被完全阻斷的SUs介導(dǎo)的胰島素分泌所導(dǎo)致的，還是體內(nèi)確實(shí)存在胰腺外降糖作用?目前尚不清楚。這在很大程度上限制了SUs的臨床應(yīng)用。明確SUs胰腺外降糖作用的存在，亟須具有說(shuō)服力的體內(nèi)研究進(jìn)行證實(shí)。不同的SUs胰腺外作用存在差異，格列齊特屬于第二代SUs，較之其他SUs，因其結(jié)構(gòu)中含有一氮雜環(huán)而具備許多特殊功能，比如在血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)中格列美脲和格列本脲通過(guò)結(jié)合SUR2B促其遷移增殖，而沒(méi)有作用位點(diǎn)的格列齊特則通過(guò)調(diào)控NF-κB抑制其遷移增殖，表現(xiàn)出不同的胰腺外作用(第一部分)。目前有研究顯示格列齊特在改善血糖方面，同樣存在胰腺外作用，但缺乏有力證實(shí)，本研究中以格列齊特為代表，對(duì)SUs胰腺外降糖作用進(jìn)行研究。為確證格列齊特體內(nèi)胰腺外降糖作用的存在，本研究擬將大鼠SURl基因敲除，構(gòu)建SURl~大鼠模型。在該模型中，格列齊特胰島β細(xì)胞作用受體(SURl)缺失，其介導(dǎo)的促胰島β細(xì)胞分泌胰島素作用被完全阻斷。在此基礎(chǔ)上建立2型糖尿病模型并給予藥物刺激，即可觀察格列齊特對(duì)胰腺外組織的直接影響，明確其胰腺外降糖作用及機(jī)制。同時(shí)我們選取不通過(guò)結(jié)合SURl促胰島素分泌發(fā)揮降糖作用的藥物——二甲雙胍作為標(biāo)準(zhǔn)藥物對(duì)照組，以便更好的對(duì)格列齊特的胰腺外降糖作用進(jìn)行對(duì)比觀察。研究目的1、闡明格列齊特體內(nèi)胰腺外降糖作用的存在。2、探究格列齊特胰腺外降糖作用的機(jī)制。研究方法1、SUR1基因敲基因大鼠的構(gòu)建及培養(yǎng)：構(gòu)建SUR1基因敲除大鼠(TALEN基因敲除技術(shù))。并通過(guò)篩選和育種，獲取SUR1-/-大鼠。2、2型糖尿病模型建立及實(shí)驗(yàn)分組健康雄性SUR1-/-大鼠，體重～120g左右。高脂飼料喂養(yǎng)，4周后行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及胰島素耐量試驗(yàn)(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)，選取建立胰島素抵抗的SURl~鼠給予腹腔一次性注射27.5mg/kg鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)2周后測(cè)定空腹血糖，連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1mmol/l，且伴有多飲、多食、多尿癥狀的大鼠被認(rèn)為建模成功。成功建立2型糖尿病的SUR1-/-鼠再次行IPGTT及IPITT檢測(cè)，并隨機(jī)分為3組：①格列齊特組(Gliclazide組，10mg/kg/d)；②二甲雙胍組(Metformin，212.5mg/kg/d)；③對(duì)照組(Control組)。通過(guò)灌胃的方式給藥，Control組給予生理鹽水灌胃，喂藥時(shí)間2周。2周后重復(fù)IPGTT及IPITT檢測(cè)，并對(duì)各組實(shí)驗(yàn)鼠行高胰島素-t常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，鉗夾結(jié)束后將動(dòng)物安樂(lè)死，取材。3、血糖與體重：測(cè)定①用藥前、②用藥后1周、③用藥結(jié)束，各組實(shí)驗(yàn)鼠空腹血糖及體重，并記錄。4、IPGTT及IPITTIPGTT:實(shí)驗(yàn)鼠禁食12小時(shí)后，以葡萄糖1g/kg劑量，對(duì)其進(jìn)行腹腔注射，使用血糖儀分別測(cè)定Omin、15min、30min、60min及120min尾靜脈血血糖，將測(cè)量的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖繪制成曲線(xiàn)，計(jì)算曲線(xiàn)下面積(areas under curve，AUC)。IPITT：實(shí)驗(yàn)鼠禁食4小時(shí)后，胰島素1U/kg，腹腔注射，使用血糖儀分別測(cè)定0min、15rain、30min、60min及120min尾靜脈血血糖，繪制曲線(xiàn)，計(jì)算AUC。5、高胰島素-正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)每組分別取6只實(shí)驗(yàn)鼠，在鉗夾實(shí)驗(yàn)前1周采用戊巴比妥鈉將其麻醉，于左側(cè)股動(dòng)脈置管，并將所置入的導(dǎo)管從頸背部引出、固定，以防止實(shí)驗(yàn)鼠撕咬。置管大鼠禁食16小時(shí)后開(kāi)始高胰島素.正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。①采用26G留置針穿刺尾靜脈并接入三通，此為同時(shí)輸注胰島素及葡萄糖的通道；②1周前置入的股動(dòng)脈管作為采血通道。首先采集空腹血，并通過(guò)血糖儀測(cè)定空腹血糖數(shù)值，輸注胰島素(10mU/kg/min)及葡萄糖(隨時(shí)調(diào)整輸注速度)，每5min測(cè)一次血糖并對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，待1小時(shí)左右將血糖穩(wěn)定在～6.0mmol/l，將各時(shí)間點(diǎn)葡萄糖輸注速度做好詳細(xì)記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠安樂(lè)死并取材。6、標(biāo)本的留�。恒Q夾實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠麻醉，心臟灌注后取肝臟、股四頭肌肉及附睪處脂肪，取材后將一部分組織固定于10%中性甲醛中，24小時(shí)后脫水并石蠟包埋；一部分包埋于OCT中；剩余部分組織液氮速凍，-80℃冰箱保存。7、組織病理學(xué)檢查及免疫熒光染色檢查：應(yīng)用periodic acid-Schiff(PAS)染色方法使5μm厚度肝臟石蠟切片糖原顯色；應(yīng)用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(glucose transporter 4，GLUT4)抗體測(cè)定OCT包埋61μm厚度冰凍切片肌肉及脂肪組織中GLUT4表達(dá)及分布情況。8、免疫印跡(western blot)檢測(cè)：取凍存于.80℃的新鮮肝臟、肌肉及脂肪組織，分別提取總蛋白及膜蛋白，應(yīng)用Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK抗體測(cè)定肝臟Akt及AMPK磷酸化激活程度，應(yīng)用GLUT4、PPAR-7、Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK測(cè)定肌肉及脂肪組織中總GLUT4、膜GLUT4、PPAR-7表達(dá)水平及Akt 及AMPK磷酸化激活程度。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，全部數(shù)據(jù)均用mean±SE表示，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P0.05(雙側(cè))被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01(雙側(cè))被認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1、SURl敲基因大鼠構(gòu)建及SUR1-/-鼠培育：Abcc8(SUR1)基因敲除，成功構(gòu)建TALEN載體、線(xiàn)性化載體并倒入胚胎干細(xì)胞、成功篩選同源重組的胚胎干細(xì)胞、通過(guò)顯微注射方式將胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入囊胚、成功獲取嵌合體大鼠并與野生型大鼠雜交獲取雜合體大鼠、再次雜交獲取SUR1-/-大鼠。采用PCR、Sanger測(cè)序及western blot方法證實(shí)SURF-/-大鼠獲取成功。2、動(dòng)物一般情況大鼠喂養(yǎng)高脂飼料4周后，經(jīng)測(cè)定全部產(chǎn)生胰島素抵抗。STZ注射后，共27只大鼠血糖達(dá)到2型糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn)，血糖未達(dá)標(biāo)的大鼠被排除出實(shí)驗(yàn)。格列齊特組及對(duì)照組分別有1只實(shí)驗(yàn)鼠在實(shí)驗(yàn)未完成前死亡，死因不詳。3、各組實(shí)驗(yàn)鼠體重及血糖情況①體重：二甲雙胍組實(shí)驗(yàn)鼠體重輕微下降，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，對(duì)照組及格列齊特組大鼠體重實(shí)驗(yàn)前后無(wú)明顯改變。②空腹血糖情況：各組實(shí)驗(yàn)鼠用藥前空腹血糖基線(xiàn)數(shù)值一致。用藥2周后，各組空腹血糖出現(xiàn)明顯差異。格列齊特組大鼠與對(duì)照組相比，空腹血糖降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，但其降低程度較二甲雙胍組要弱(P0.01)。證實(shí)格列齊特有胰腺外降糖作用。③IPGTT：各組實(shí)驗(yàn)鼠用藥前IPGTT基線(xiàn)數(shù)值無(wú)差異。用藥2周后，與對(duì)照組相比二甲雙胍組IPGTT AUC下降明顯，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)，然而格列齊特組IPGTTAUC雖有降低，但與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。提示格列齊特有胰腺外調(diào)節(jié)糖代謝的能力，但較弱。④IPITT.各組實(shí)驗(yàn)鼠用藥前IPITT基線(xiàn)數(shù)值無(wú)差異。用藥2周后，與對(duì)照組相比較格列齊特組大鼠胰島素注射后，血糖曲線(xiàn)下降明顯，但是不如二甲雙胍組顯著。對(duì)各組胰島素耐量改善狀況進(jìn)行排序：二甲雙胍組格列齊特組對(duì)照組。提示格列齊特有緩解胰島素抵抗作用。4、高胰島素一正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)高胰島素-]E常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，采用血糖穩(wěn)定后，即鉗夾60-120分鐘葡萄糖輸注率(GIR)平均值來(lái)反映全身葡萄糖利用情況。格列齊特組大鼠GIR升高(vs.對(duì)照組，P0.05)；但比二甲雙胍組低(P0.05)。明確格列齊特具有胰腺外緩解胰島素抵抗作用，但其緩解胰島素抵抗能力弱于二甲雙胍。5、肝臟胰島素抵抗改善結(jié)果①肝臟糖原染色結(jié)果肝臟是機(jī)體糖代謝的主要器官，肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗可明顯升高機(jī)體血糖。肝糖原儲(chǔ)備降低是肝臟胰島素抵抗的主要表現(xiàn)之一。為了檢測(cè)SURl基因敲除后格列齊特對(duì)大鼠肝臟中糖原儲(chǔ)備的影響，我們對(duì)各組大鼠肝臟組織切片并行PAS染色，發(fā)現(xiàn)格列齊特雖然不如二甲雙胍能夠強(qiáng)烈的增加肝糖原的含量，但是有直接增加肝糖原儲(chǔ)備的作用(vs.對(duì)照組)。②肝臟組織Akt、AMPK磷酸化激活情況肝臟組織磷酸化/總Akt顯示Akt磷酸化激活情況，結(jié)果示：與對(duì)照組相比較，格列齊特可提高肝臟Akt的激活程度(P0.05)，二甲雙胍則表現(xiàn)為顯著激活肝臟Akt(P0.01)；與二甲雙胍組相比較，格列齊特組肝臟Akt激活程度較弱(P0.05)。肝臟組織磷酸化/總AMPK顯示AMPK磷酸化激活情況，結(jié)果示：格列齊特不能激活肝臟AMPK(vs.對(duì)照組，P0.05)；二甲雙胍則明顯激活肝臟AMPK(vs.對(duì)照組，P0.01；vs.格列齊特組，P0.05)。6、肌肉及脂肪組織胰島素抵抗改善結(jié)果①肌肉及脂肪組織總GLUT4及膜GLUT4表達(dá)檢測(cè)外周組織葡萄糖代謝障礙是胰島素抵抗的另一主要表現(xiàn)。葡萄糖攝取是糖代謝過(guò)程中主要限速步驟，而肌肉(骨骼肌)及脂肪組織則介導(dǎo)了大部分胰島素刺激的葡萄糖攝取。GLUT4是肌肉及脂肪組織攝取葡萄糖的主要載體。我們對(duì)各組實(shí)驗(yàn)鼠股四頭肌及附睪處脂肪組織總GLUT4及膜GLUT4(GLUT4表達(dá)在膜上介導(dǎo)葡萄糖的攝取)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：a.免疫熒光染色顯示：格列齊特組肌肉及脂肪細(xì)胞胞漿及胞膜處GLUT4均明顯增加；二甲雙胍組GLUT4表達(dá)較格列齊特組弱，僅于部分胞膜處熒光可見(jiàn)；對(duì)照組GLUT4熒光最弱。b.western blot結(jié)果顯示：在肌肉組織中，與對(duì)照組比較，格列齊特組總GLUT4及膜GLUT4表達(dá)均顯著增加(總GLUT4：vs.對(duì)照組，P0.01；膜GLUT4：vs.對(duì)照組，P0.01)；二甲雙胍組，總GLUT4無(wú)明顯變化，但膜GLUT4表達(dá)增加(總GLUT4：vs.對(duì)照組，P0.05；膜GLUT4.vs.對(duì)照組，P0.01)；格列齊特組與二甲雙胍組膜GLUT4表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。在脂肪組織中，與對(duì)照組及二甲雙胍組相比較，格列齊特組總GLUT4及膜GLUT4表達(dá)增加(P0.05)；二甲雙胍不增加脂肪組織總GLUT4及膜GLUT4的表達(dá)(總GLUT4-vs.對(duì)照組，P0.05；膜GLUT4-vs.對(duì)照組，P0.05)。②肌肉及脂肪組織Akt激活情況肌肉組織磷酸化/總Akt顯示Akt激活，結(jié)果示：格列齊特組肌肉組織Akt激活明顯，是對(duì)照組的1.75倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(vs.對(duì)照組，P0.01)；二甲雙胍對(duì)Akt激活增強(qiáng)作用在肌肉組織中稍弱，是對(duì)照組的1.41倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(vs.對(duì)照組，P0.01)。在脂肪組織中，格列齊特組脂肪組織Akt磷酸化激活明顯(vs.對(duì)照組，P0.05)，二甲雙胍組脂肪中Akt不激活(vs.對(duì)照組，P0.05)，格列齊特組與二甲雙胍組相比較，Akt激活明顯(P0.05)。③肌肉及脂肪組織AMPK激活情況不同于二甲雙胍顯著激活肌肉及脂肪組織AMPK，格列齊特不激活肌肉及脂肪組織AMPK(vs.對(duì)照組，P0.05)。④肌肉及脂肪組織PPAR-γ檢測(cè)格列齊特能明顯促進(jìn)SURF-/-大鼠肌肉組織中PPAR-γ表達(dá)，與對(duì)照組相比較，格列齊特組PPAR-γ表達(dá)量提高了1.47倍(P0.01)；與二甲雙胍組相比較，格列齊特促PPAR-γ表達(dá)也較明顯(P0.05)。在脂肪組織中，格列齊特促進(jìn)PPAR-7表達(dá)的作用更加顯著，是對(duì)照組的4.61倍(vs.對(duì)照組，P0.01)，且高于二甲雙胍組脂肪組織中PPAR-γ的表達(dá)量(P0.05)。研究結(jié)論1、格列齊特除傳統(tǒng)的促胰島β細(xì)胞分泌胰島素降糖作用外，還具有胰腺外降糖作用。2、格列齊特胰腺外改善血糖代謝及胰島素抵抗的能力較二甲雙胍弱，其胰腺外降糖作用機(jī)制與二甲雙胍不同，二甲雙胍主要是緩解肝臟組織胰島素抵抗，格列齊特則主要是緩解肌肉及脂肪組織胰島素抵抗。3、格列齊特能明顯促肌肉及脂肪組織中GLUT4的表達(dá)及轉(zhuǎn)位，其作用機(jī)制可能與PPAR-y及Akt通路激活有關(guān)。SUs一直被認(rèn)為是通過(guò)胰島素促泌作用來(lái)降低血糖，緩解糖尿病患者病情。本研究通過(guò)將SUs胰島β細(xì)胞上作用受體基因——SURl敲除，SURl表達(dá)缺失，SUs促胰島素分泌作用被阻斷，觀察第二代SUs——格列齊特對(duì)SURl基因敲除后2型糖尿病大鼠的影響。證實(shí)格列齊特在失去促胰島β細(xì)胞分泌胰島素降糖能力后，仍然可以直接作用于外周組織，緩解胰島素抵抗?fàn)顩r，改善糖代謝。明確其同時(shí)具有促胰島素分泌降糖及緩解胰島素抵抗降糖兩方面作用，為今后的用藥指導(dǎo)提供依據(jù)。
【圖文】：

圖１．兔骼動(dòng)脈再狹窄模型手術(shù)示意圖及各手術(shù)時(shí)間點(diǎn)超聲圖

圖２．建模２８天各實(shí)驗(yàn)組建模部位血管超聲圖像。逡逑Ａ：非糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔血管超盧圖；Ｂ：糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化組實(shí)驗(yàn)兔血管超逡逑聲圖；Ｃ：非糖尿病再狹窄組實(shí)驗(yàn)兔血管超盧圖；Ｄ：糖尿病巧狹窄實(shí)驗(yàn)兔血管超盧圖逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2


本文編號(hào)：2547781