【摘要】：背景： 動脈粥樣硬化((?)therosclerosis, AS)是對人類健康產(chǎn)生嚴重危害的疾病。由AS引起的心腦血管疾病發(fā)病率及死亡率現(xiàn)已居全球首位。隨著社會與經(jīng)濟的發(fā)展,近年來AS在我國引起的心腦血管疾病發(fā)病率與死亡率也逐年增加。 AS的形成原因非常復雜,其發(fā)病機制至今尚未完全明確。慢性炎癥反應在AS的形成和發(fā)展過程中起到了關鍵作用,抗炎治療是防治AS的重要策略。內(nèi)臟脂肪素(visfatin)是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子,臨床研究發(fā)現(xiàn)AS患者血清visfatin顯著升高,且常伴有炎癥因子表達的增多。因此,我們推測visfatin可能作為一種促炎因子參與了AS的炎癥反應過程。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)信號通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi),其中主要有p38分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-jun-N-terminal kinase, JNK)和細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)三條途徑。JNK通路和p38MAPK通路主要對炎性細胞因子和多種類型的細胞應激信號進行轉(zhuǎn)導,而ERK通路主要對細胞的生長、分裂和分化信號進行轉(zhuǎn)導,研究表明p38MAPK、ERK和JNK三種通路均參與了AS的病理過程。我們推測visfatin促炎反應的機制可能與調(diào)控MAKPs信號通路有關。 中醫(yī)學無“冠狀動脈粥樣硬化”病名,一般認為其屬于中醫(yī)學“胸痹”、“中風”、“心痛”等范疇,病因多與“虛”、“瘀”、“痰”、“痰瘀"、“毒”等有關,病機多屬于本虛標實,虛實夾雜�，F(xiàn)代醫(yī)學目前對于AS的治療通常以他汀類藥物為主,但長期使用此類藥物可產(chǎn)生肝毒性、肌病、神經(jīng)毒性、胃腸道反應等副作用,制約了其在臨床的廣泛使用。中藥復方定心方是導師賈鈺華教授研制的治療心血管疾病的經(jīng)驗方,經(jīng)過多年的臨床和實驗研究證明,定心方具有抗心肌缺血及再灌注損傷、抗心律失常、抗AS等作用,其主要成分之一中藥黃連具有清熱解毒的功效,同時具有多重心血管效應,黃連的有效提取物小檗堿治療AS療效顯著,可通過調(diào)節(jié)血脂、抑制氧化應激、減少細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞能量代謝、抑制E-選擇蛋白、炎癥因子的表達及提高脂聯(lián)素水平等多方面來發(fā)揮抗AS的作用,但其抗AS作用機制是否通過調(diào)節(jié)與炎癥有關的脂肪細胞因子visfatin的表達尚缺乏更深入的研究。我們推測小檗堿可能通過調(diào)控visfatin的表達,從而發(fā)揮抗AS的作用,此作用機制可能與調(diào)控MAKPs信號通路有關。 載脂蛋白E基因敲除(ApoE knockout, ApoE-/-)小鼠因其可產(chǎn)生泡沫細胞的堆積和血漿膽固醇的顯著增高等自發(fā)性損傷,已成為AS研究領域應用最多的動物模型。血管內(nèi)皮細胞損傷處于AS發(fā)生、發(fā)展過程中的早期階段,保護血管內(nèi)皮免受各種炎癥因子的侵害,是抗AS發(fā)生、發(fā)展的關鍵。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)在生物學特性的很多方面與動脈內(nèi)皮細胞特征很相似,在疾病與血管功能尤其是AS的病理生理及形成機制研究中受到廣泛的重視。本研究擬應用ApoE-/-小鼠加上高脂飼料喂養(yǎng)的方法制作AS動物模型,應用HUVEC作為細胞模型,分別從體內(nèi)和體外兩個方面研究visfatin在AS中的促炎癥作用,應用MAPKs信號通路特異性抑制劑探討其促炎癥反應具體機制,并研究小檗堿對visfatin促炎癥反應的干預作用及其機制,為中醫(yī)藥防治AS尋找新的靶點。 目的： 1.建立AS動物模型,研究visfatin在AS小鼠血清和主動脈組織中的表達情況及小檗堿的干預作用； 2.研究AS小鼠血清脂質(zhì)、血漿白介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)含量及小檗堿的干預作用； 3.研究小鼠主動脈AS斑塊形態(tài)學測定,并檢測AS斑塊內(nèi)visfatin表達,探討小檗堿的干預作用。 4.研究visfatin是否能誘導HUVEC分泌炎癥因子IL-6、TNF-α,及其促炎癥作用是否受p38MAPK、ERK和JNK信號通路的調(diào)節(jié)。 5.研究小檗堿在visfatin誘導HUVEC分泌炎癥因子IL-6、TNF-α過程中的干預作用及其機制是否受p38MAPK、ERK和JNK信號通路的調(diào)節(jié)。 方法： 1.動物部分 50只8周齡雄性ApoE-/-小鼠,隨機分為5組,每組10只,分別為：①模型組、②小檗堿低劑量組、③小檗堿中劑量組、④小檗堿高劑量組、⑤辛伐他汀組,均予高脂飼料喂養(yǎng)；以10只8周齡雄性C57BL/6J小鼠作為⑥對照組,予普通飼料喂養(yǎng)。②、③、④組分別給予小檗堿2.5、5、7.5mg/kg腹腔注射,每日一次；⑤組給予辛伐他汀藥液灌胃5mg/kg,每日一次；①、⑥組灌服等劑量生理鹽水,每周測體重一次,實驗為期16周。 腹腔麻醉小鼠,眼球摘除法采血。行心臟灌注,自小鼠主動脈根部至腹主動脈末端部分離整條主動脈,部分主動脈組織用4%多聚甲醛中固定,其余放入液氮中保存。 主動脈組織行石蠟包埋、切片、髓染色觀察小鼠主動脈組織病理形態(tài)學改變,比較各組斑塊面積百分比；免疫組化法檢測小鼠主動脈AS斑塊visfatin的表達；分離血清及血漿,測血清甘油三脂(triglycerides, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)含量；ELISA法檢測血清visfatin含量及血漿IL-6、TNF-α含量；主動脈組織提取蛋白,westernblotting測小鼠主動脈visfatin的表達。用SPSS13.0軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析,P0.05為具有統(tǒng)計學意義。 2.細胞部分 HUVEC分成以下各組： Visfatin濃度梯度組：分別以0、50、100、200μg·L-1visfatin作用HUVEC24h。 Visfatin時間梯度組：以100μg·L-1visfatin分別作用HUVEC0、6、12、24、48h。 藥物干預組：共分為7組：①對照組；②小檗堿組：加入50μmol·L-1小檗堿孵育24h;③visfatin+小檗堿組：加入50μmol·L-1小檗堿預孵育1h后再加入visfatin100μg·L-1刺激24h;④visfatin組：加入visfatin100μg·L-1刺激24h；⑤visfatin+PD98059組：加入PD98059(終濃度為20μmol·L-1)預處理細胞30min,再給予visfatin100μg·L-1刺激24h;⑥visfatin+SB203580組：加入SB203580(終濃度為20μmol·L-1)預處理細胞30min,再給予visfatin100μg·L-1刺激24h；⑦visfatin+SP600125組：加入SP600125(終濃度為10μmol·L-1)預處理細胞30min,再給予visfatin100μg·L-1刺激24h。 MTT法檢測visfatin對HUVEC增殖的影響及小檗堿的干預作用；收集各組HUVEC上清液,ELISA法測上清液中IL-6、TNF-α含量,研究visfatin誘導HUVEC分泌炎癥因子的作用及小檗堿的干預作用；冰上裂解HUVEC、提取各組HUVEC蛋白,BCA法行蛋白樣品定量,western blotting法檢測p38MAPK、 ERK、JNK蛋白及其磷酸化蛋白的表達,研究visfatin誘導HUVEC炎癥反應作用機制與p38MAPK、ERK、JNK三種炎癥信號轉(zhuǎn)導通路的關系,及小檗堿的抗AS作用機制是否通過調(diào)節(jié)p38MAPK、ERK、JNK三種炎癥信號轉(zhuǎn)導通路抑制visfatin誘導HUVEC分泌炎癥因子IL-6、TNF-α來實現(xiàn)。用SPSS13.0軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析,P0.05為具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.小鼠體重測量結(jié)果顯示：各給藥組體重增加值均顯著低于模型組(P=0.00)；小檗堿高劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿低劑量組體重增加值與辛伐他汀組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；小檗堿高劑量組與小檗堿中劑量組、小檗堿低劑量組體重增加值無顯著差異(P0.05)。 2.血脂檢測結(jié)果：模型組血脂水平顯著高于對照組(P0.05),各給藥組血清TG、TC、LDL-C水平均低于模型組,HDL-C高于模型組。與模型組相比,小檗堿高劑量組、辛伐他汀組血清TC、TG、LDL-C顯著降低(P0.05)。小檗堿高劑量組血脂水平低于小檗堿低、中劑量組,其中TG水平降低尤為明顯(P0.05)。 3.小鼠主動脈AS斑塊病變形態(tài)學觀察：對照組未見AS病灶。模型組較辛伐他汀組、小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組AS斑塊面積百分比顯著增高(P=0.00)；小檗堿高劑量組AS斑塊面積百分比顯著低于小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組(P0.05)；小檗堿低劑量組與小檗堿中劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；小檗堿高劑量組與辛伐他汀組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4小鼠主動脈AS斑塊visfatin的表達：各給藥組visfatin表達較模型組均顯著升高(P0.05)；小檗堿高劑量組與小檗堿中劑量組、小檗堿低劑量組visfatin表達均有顯著差異(P0.05)；小檗堿高劑量組與辛伐他汀組visfatin表達無顯著差異(P0.05)。 5小鼠血清visfatin水平：辛伐他汀組、小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組小鼠血清visfatin水平較模型組顯著降低(P=0.00)；小檗堿低劑量組小鼠血清visfatin水平較小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組顯著增高(P0.05)；小檗堿高劑量組小鼠血清visfatin水平與辛伐他汀組無顯著差異(P0.05)；小檗堿高劑量組小鼠血清visfatin水平與小檗堿中劑量組無顯著差異(P=0.062)。 6.小鼠主動脈visfatin蛋白的表達：各給藥組小鼠主動脈visfatin蛋白表達顯著低于模型組(P0.05)；小檗堿低劑量組小鼠主動脈visfatin蛋白表達顯著高于辛伐他汀組(P0.00)；小檗堿高劑量組小鼠主動脈visfatin蛋白表達顯著低于辛伐他汀組(P0.00)；辛伐他汀組小鼠主動脈visfatin蛋白表達與小檗堿中劑量組無顯著差異(P0.166)。 7.小鼠血漿IL-6、TNF-α含量：各給藥組小鼠血漿IL-6、TNF-α水平均顯著低于模型組小鼠(P0.00)；辛伐他汀組小鼠血漿IL-6與小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；小檗堿低劑量組小鼠血漿IL-6與小檗堿中劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.277)；小檗堿高劑量組小鼠血漿IL-6與小檗堿中劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.343)。小檗堿高劑量組小鼠血漿TNF-α與辛伐他汀組、小檗堿中劑量組、小檗堿低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；辛伐他汀組小鼠血漿TNF-α顯著低于小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組(P0.05)；小檗堿低劑量組小鼠血漿TNF-α與小檗堿中劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 8.Visfatin對HUVEC增殖的影響：visfatin濃度梯度組結(jié)果顯示：50、100、150、200μg·L-1visfatin組均可顯著抑制HUVEC增殖(P0.05)；100μg·L-1visfatin與150μg·L-1visfatin組、200μg·L-1visfatin組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；visfatin時間梯度組結(jié)果顯示：與對照組相比,100μg·L-1visfatin作用12h、24h、48h后均能顯著抑制]3UVEC增殖(P0.05),100μg·L-1visfatin作用24h與作用3h、6h、12h相比對HUVEC增殖抑制的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；100μg·L-1visfatin組作用24h與作用48h對HUVEC增殖抑制的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 9小檗堿及MAPKs通路抑制劑對visfatin影響HUVEC增殖的干預作用：50、100μmol·L-1小檗堿均可顯著減輕visfatin對HUVEC增殖的抑制作用(P=0.00)；兩組間無顯著差異;P0.05)。 PD98059、SB203580和SP600125均可顯著減輕visfatin對于IUVEC增殖的抑制(P0.05),三組間無顯著差異(P0.05)；PD98059、SB203580和SP600125減輕visfatin對]HUVEC增殖的抑制能力與小檗堿組無顯著差異(P0.05)。 10.Visfatin對HUVEC中p-ERK1/2蛋白表達的影響：濃度梯度組結(jié)果顯示：50μg·L-1visfatin作用24h后即可顯著增高HUVEC中p-ERK1/2蛋白的表達(P--0.00),100、200μg·L-1visfatin作用24h后HUVEC中p-ERK1/2蛋白表達的增高較50μg·L-1visfatin組有顯著差異(P=0.00)；時間梯度組結(jié)果顯示：100μg·L-1visfatin作用12h后可顯著增高HUVEC中p-ERK1/2蛋白的表達;P=0.024),100μg·L-1visfatin作用24h、48h組較作用12h組HUVEC中p-ERK1/2蛋白表達增高的差異具有顯著性(P=0.00),24h和48h兩組間無顯著差異(P=0.236)。 11. Visfatin對HUVEC中p-p38MAPK蛋白表達的影響：濃度梯度組結(jié)果顯示：50μg·L-1visfatin作用24h后即可顯著提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表達(P=0.016),100μg·L-1visfatin作用24h后此作用達到峰值(P=0.00),100μg·L-1visfatin組與200μg·L-1visfatin組對于提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表達,兩組間無顯著差異(P=0.317)；時間梯度組結(jié)果顯示：100μg·L-1visfatin作用作用12h后即可顯著提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表達(P=0.003),作用24h后提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表達作用達到峰值(P=0.00)。 12.Visfatin對3UVEC中p-JNK蛋白表達的影響：濃度梯度組結(jié)果示：100μg·L-1visfatin組和200μg·L-1visfatin作用24h后均可顯著提高HUVEC中p-JNK蛋白的表達(P=0.00),兩組間無顯著差異(P=0.593)；時間梯度組結(jié)果顯示：100μg-L-1visfatin作用12h后可顯著提高HUVEC中p-JNK蛋白的表達(P=0.001),與作用6h組有顯著差異(P=0.008),作用24h后提高IUVEC中p-JNK蛋白的表達作用達到峰值(P=0.00)。 13. Visfatin誘導HUVEC分泌TNF-α、IL-6的作用：濃度梯度組結(jié)果示：100、200μg·L-1visfatin分別作用24h均可顯著誘導HUVEC分泌TNF-a及IL-6(P=0.00),100μg·L-1visfatin誘導HUVEC分泌TNF-a作用顯著高于200μg·L-1visfatin組(P=0.00)。時間梯度組結(jié)果顯示：100μg·L-1visfatin作用6h后即可顯著誘導HUVEC分泌TNF-a(P=0.001),作用24h后達峰值(P=0.00)。100μg·L-1visfatin作用12h后可顯著誘導HUVEC分泌IL-6(P=0.00),作用24h后達峰值(P=0.00),較12h組有顯著提高(P=0.00)。 14.小檗堿及MAPKs通路抑制劑對HUVEC中p-ERK1/2, p-p38MAPK、JNK蛋白表達的影響：與visfatin組相比,小檗堿和PD98059均可顯著降低HUVEC中p-ERK1/2蛋白的表達(P=0.00)；小檗堿和SB203580均可顯著降低HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表達(P=0.00)；小檗堿和SP600125均可顯著降低HUVEC中p-JNK蛋白的表達(P=0.00)。 15小檗堿及MAPKs通路抑制劑對visfatin誘導HUVEC分泌TNF-α、IL-6的干預作用：與visfatin組相比,用50μmol·L-1小檗堿預先處理HUVEC1h可顯著降低HUVEC分泌TNF-α、IL-6水平(P=0.00);PD98059、SB203580、SP600125均可顯著降低由visfatin誘導的HUVEC分泌炎癥因子TNF-α及IL-6(P0.05)。 結(jié)論： 1.小檗堿對AS小鼠具有減體重及降血脂作用。 2.AS小鼠主動脈及斑塊內(nèi)visfatin顯著增高,小檗堿可抑制ApoE-/-小鼠主動脈AS斑塊病變的形成,并降低AS主動脈及斑塊內(nèi)visfatin的表達。 3.AS小鼠血清visfatin顯著增高,小檗堿可降低AS小鼠血清visfatin含量。 4.AS小鼠血漿炎癥因子TNF-α、IL-6水平顯著增高,小檗堿可降低AS小鼠血漿TNF-α、IL-6水平。 5. Visfatin可呈濃度和時間依賴性顯著抑制HUVEC增殖并明顯誘導HUVEC分泌TNF-α、IL-6其機制可能通過激活p38MAPK, ERK1/2和JNK通路實現(xiàn)；小檗堿可顯著減少visfatin對HUVEC增殖的抑制,可明顯降低由visfatin誘導的HUVEC分泌炎癥因子TNF-α及IL-6,可能與抑制p38MAPK, ERK1/2和JNK通路有關。 綜上,動物實驗證實AS小鼠具有高血脂,炎癥因子TNF-α、IL-6及與炎癥有關的脂肪細胞因子visfatin的高度表達的特征,小檗堿可通過降血脂、抑制AS斑塊的形成、減少TNF-α、IL-6的含量、下調(diào)visfatin的表達等方面延緩AS的發(fā)生發(fā)展。細胞實驗證實visfatin可損傷內(nèi)皮細胞并可誘導內(nèi)皮細胞分泌炎癥因子,小檗堿可通過保護內(nèi)皮細胞及減少炎癥因子的分泌發(fā)揮抗AS作用,其機制可能有抑制MAPKs信號通路有關。
【圖文】：

劑量組、小檗堿低劑量組體重增加值無顯著差異(P>0.05),小檗堿中劑量組與小檗堿低劑量組體重增加值無顯著差異(P>0.05)。見表1-1及圖1-1。表1-1小鼠體重增加值對比Tabl-1 Comparison of added vaule of mice weight(n=10，x 士s, g)"i別 體重增加值 —對照組 9.42±0.74_#模型組 11.63±1.44#辛伐他汀組 6.74±1.11_小呭喊低劑量組 7.26±0.89*小檗堿中劑量組 6.93±0.91_小檗堿高劑量組 6.17±0.78' _F 43.119 _P 0.00 與模型組比，，'^<0.05;與辛伐他汀組比，?0.0519

顯著差異(P>0.05);小檗堿高劑量組與小檗堿中劑量組血清HDL-C水平無顯著差異(尸=0.647)。見表1-2及圖1-2�！� 表1-2小鼠血清脂質(zhì)水平Tab 1-2 Serum lipids levels of mice(n=5, X 士s，nimol/L )組另 ij TC TG HDL-C LDL-C 對照組 7.22±0.34*# 1.02±0.25*# 4.54±0.36* 1.07±0.39'#模型組 22.24±1_82# 10.14±0.85# 1.97±0.89# 6.50±0.43*辛伐他汀組 13.54±0.85* 3.58±0.59* 3.92±0.75* 2.18±0.29*小檗堿低組 16.94±0.57'# 4.81±0.59** 2.25±0.76# 3.72±0.37**小檗堿中組 14.98±0.67'# 4.18±0.47* 2.65±0.56# 2.30±0.22*小檗堿高組 13.04±0.85* 2.32±0.46'# 3.54±0.45' 2.02 士 0.35._￡ 129.120 154.541 11.934 154.235 P 0￡0 ^^ 與模型組比，><0.05;與辛伐他汀組比，#P<0.0525-, - 了 TC tSBSS TG-: kd 20- i ES3 LDL-C 口 HDL-C"5 - ？sI 

本文編號：2541076