【摘要】：目的:觀察益氣解毒活絡(luò)方對(duì)高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導(dǎo)的早期糖尿病腎病(DN)大鼠相關(guān)藥效學(xué)指標(biāo)、腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響,及藥物作用機(jī)制指標(biāo)的變化,從ERK1/2信號(hào)通路途徑探討益氣解毒活絡(luò)方對(duì)早期DN防治作用的可能的分子機(jī)制。材料與方法:健康Wistar大鼠(SPF級(jí))雌雄各45只,體重(280±20)g,以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,準(zhǔn)確稱取體質(zhì)量,按大鼠體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常組10只、造模組80只,均雌雄各半。正常組大鼠以普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng),造模組大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)1周后,禁食不禁水12h,準(zhǔn)確稱量體質(zhì)量,按42mg/kg標(biāo)準(zhǔn)單次腹腔注射STZ溶液;正常組大鼠則以等量枸櫞酸緩沖液腹腔注射。STZ溶液腹腔注射72h后,尾靜脈測(cè)空腹血糖(FBG),以FBG≥16.7 mmol/L者認(rèn)為是DM造模成功,其中血糖不達(dá)標(biāo)者8只,剔除實(shí)驗(yàn)。將72只DM成模大鼠按血糖水平重新隨機(jī)分為模型對(duì)照組16只,西藥對(duì)照組14只,中藥預(yù)防組14只,中藥高劑量組14只,中藥低劑量組14只,繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng),自由飲水。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn),按照自然病程發(fā)展,2周后出現(xiàn)早期DN,并結(jié)合尿微量白蛋白測(cè)定結(jié)果,將DN模型建立成功者納入正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)的益氣解毒活絡(luò)方由免煎中藥配方顆粒劑組成:黃精(40g)、黃芪(40g)、黃連(6g)、虎杖(30g)、澤蘭(20g)、水蛭粉(6g)。西藥對(duì)照藥選用鹽酸貝那普利片(洛汀新,10mg/片)。預(yù)防組在DM模型成功后立即灌胃,給藥量按人體(g/kg)-大鼠等效劑量的6.3倍計(jì)算;西藥組、高量組、低量組大鼠均在DN模型成功后開始灌胃,西藥組、低量組給藥量按人體(g/kg)-大鼠等效劑量的6.3倍計(jì)算;高量組按低量組的3倍。正常組、模型組灌胃等量生理鹽水,灌胃體積均為10m L/kg,每日1次,預(yù)防組灌胃10周,其余各組灌胃8周。在實(shí)驗(yàn)期間,各組大鼠自由飲食水,不予任何降糖藥物及胰島素。治療結(jié)束后,準(zhǔn)確稱量體質(zhì)量,留取尿液標(biāo)本,麻醉后腹主動(dòng)脈穿刺采血,留取全血、血漿、血清標(biāo)本,分別檢測(cè)空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿微量白蛋白、血β2微球蛋白、血尿素氮、血肌酐、全血粘度、血漿纖維蛋白原水平;光鏡下觀察腎組織HE、PAS染色病理改變;酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿及腎組織血管緊張素Ⅱ、前列腺素E2的含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠腎組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子m RNA表達(dá);蛋白印記法檢測(cè)腎組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的水平。結(jié)果:1.各組大鼠一般情況比較正常組大鼠全程無死亡,皮毛光澤,一般狀態(tài)較好,飲水量、進(jìn)食量及小便量正常,麥粒狀大便;模型組大鼠出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿、消瘦癥狀,大便溏不成形,一般狀態(tài)差,有不同程度的脫毛、尾部潰爛、眼病等并發(fā)癥;各治療組上述癥狀有所減輕。實(shí)驗(yàn)過程中共死亡8只大鼠。2.各組大鼠藥效學(xué)指標(biāo)的比較2.1各組大鼠體質(zhì)量的比較2周(DN成模)時(shí),各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);10周(取材)時(shí),與正常組比較,模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠體質(zhì)量明顯增加,以西藥組大鼠體質(zhì)量增加最明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);其它各治療組大鼠體質(zhì)量與模型組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);與預(yù)防組比較,各治療組大鼠體質(zhì)量無明顯差異,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可預(yù)防早期DN模型大鼠體質(zhì)量的下降。2.2各組大鼠空腹血糖的比較2周(DN成模)時(shí),與正常組比較,模型組大鼠血糖明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);各治療組大鼠血糖與模型組比較,無明顯差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);10周(取材)時(shí),與正常組比較,模型組大鼠血糖明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血糖明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),其中以預(yù)防組降低最明顯;與預(yù)防組比較,其它各治療組大鼠血糖升高,其中西藥組、低量組大鼠血糖與預(yù)防組大鼠血糖統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),高量組大鼠血糖與預(yù)防組大鼠血糖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠的血糖,且以早期干預(yù)效果最好。2.3各組大鼠糖化血紅蛋白、β2-MG的比較與正常組比較,模型組大鼠糖化血紅蛋白明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠糖化血紅蛋白明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);其中,以預(yù)防組大鼠糖化血紅蛋白降低最明顯,但與其他各治療組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠的糖化血紅蛋白,以預(yù)防組效果最好。與正常組比較,模型組大鼠血β2-MG明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血β2-MG明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);各治療組大鼠血β2-MG組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠血β2-MG水平。2.4各組大鼠血BUN、Scr的比較與正常組比較,模型組大鼠血BUN明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血BUN明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);各治療組大鼠血BUN組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。各治療組中,低量組大鼠尿素氮與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),其它各治療組大鼠尿素氮與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。各組大鼠血Scr無明顯變化,各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.5各組大鼠尿微量白蛋白的比較2周(DN成模)時(shí),與正常組比較,各造模組大鼠尿微量白蛋白明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);但各造模組大鼠組間尿微量白蛋白無明顯差異,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。10周(取材)時(shí),與正常組比較,模型組大鼠尿微量白蛋白明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠尿微量白蛋白明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),其中以預(yù)防組降低最明顯;與預(yù)防組比較,其他各治療組尿微量白蛋白明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠尿微量白蛋白水平,以預(yù)防組效果最好。3各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)比較HE染色:正常組大鼠腎組織未見明顯病理變化,腎小球、腎小管及系膜基質(zhì)形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常,管壁薄厚及管腔大小正常;模型組大鼠腎組織腎小球硬化,系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生,血管球萎縮,管壁薄厚不均,有不同程度的腫脹,管腔大小不一,部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性;各治療組上述病理改變有不同程度的減輕。PAS染色:正常組大鼠腎組織球、管形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常,PAS染色為陰性;模型組大鼠呈現(xiàn)彌漫性腎小球病變,個(gè)別腎小球荒廢,部分腎小球內(nèi)偶見結(jié)節(jié),腎小動(dòng)脈玻璃樣變,系膜基質(zhì)增多,基底膜增厚,PAS染色陽性物質(zhì)廣泛集中于小葉中央部;各治療組上述病理改變明顯減輕,以預(yù)防組病變較輕,腎小管及基底膜無明顯病變,腎小球系膜基質(zhì)輕度增多;西藥組大鼠腎小管萎縮,系膜基質(zhì)明顯增多,彌漫性腎小球硬化;高量組大鼠腎小球基底膜及腎小管無明顯病變,腎小球基底膜及系膜基質(zhì)增多;低量組大鼠基底膜增厚,系膜基質(zhì)增多,腎小球節(jié)段性硬化。4.各組大鼠藥物作用機(jī)制指標(biāo)的比較4.1各組大鼠全血粘度比較與正常組比較,模型組大鼠全血粘度明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠全血粘度明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);其中,以預(yù)防組大鼠全血粘度降低最明顯。與預(yù)防組比較,西藥組、低量組大鼠全血高切粘度升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),高量組大鼠全血高切粘度升高不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);西藥組、高量組大鼠全血中切粘度較預(yù)防組升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),低量組大鼠全血中切粘度較預(yù)防組升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.05);西藥組、低量組大鼠全血低切粘度較預(yù)防組升高明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),高量組大鼠全血低切粘度較預(yù)防組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠的全血粘度。4.2各組大鼠血漿FIB的比較與正常組比較,模型組大鼠血漿FIB明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血漿FIB明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);其中,以預(yù)防組血漿FIB降低最明顯。與預(yù)防組比較,西藥組大鼠血漿FIB升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),高量組大鼠血漿FIB升高不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),低量組大鼠血漿FIB升高明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠的血漿FIB,以預(yù)防組效果最好。4.3各組大鼠血漿及腎組織AngⅡ的比較與正常組比較,模型組大鼠血漿、腎組織中血管緊張素Ⅱ含量明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血漿、腎組織中血管緊張素Ⅱ含量明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與預(yù)防組比較,西藥組、高量組大鼠血漿中血管緊張素Ⅱ含量升高,低量組大鼠血漿中血管緊張素Ⅱ含量降低,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);西藥組、高量組大鼠腎組織中血管緊張素Ⅱ含量較預(yù)防組升高明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),低量組大鼠腎組織中血管緊張素Ⅱ含量較預(yù)防組升高不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠的AngⅡ含量。4.4各組大鼠血漿及腎組織PGE2的比較與正常組比較,模型組大鼠血漿及腎組織PGE2明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血漿及腎組織PGE2明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與預(yù)防組比較,西藥組、高量組大鼠血漿中PGE2含量升高,低量組大鼠血漿中PGE2降低,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);西藥組、高量組大鼠腎組織中PGE2較預(yù)防組升高明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),低量組大鼠腎組織中PGE2較預(yù)防組降低不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠的PGE2含量。4.5各組大鼠腎組織CTGF m RNA及蛋白表達(dá)的比較正常組大鼠腎組織中CTGF m RNA少量表達(dá),與正常組比較,模型組大鼠腎組織CTGF m RNA表達(dá)明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠腎組織CTGF m RNA表達(dá)明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);其中,以預(yù)防組降低最明顯。與預(yù)防組比較,其他各治療組大鼠腎組織CTGF m RNA表達(dá)明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01)。正常組大鼠腎組織勻漿可見少量CTGF蛋白表達(dá),與正常組比較,模型組大鼠腎組織勻漿CTGF蛋白表達(dá)明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠腎組織勻漿CTGF蛋白表達(dá)明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);其中,以預(yù)防組降低最明顯。與預(yù)防組比較,其他各治療組大鼠腎組織勻漿CTGF蛋白表達(dá)明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01)。上述結(jié)果提示,實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠腎組織CTGF m RNA及蛋白表達(dá),以預(yù)防組效果最好。4.6各組大鼠腎組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的比較與正常組比較,模型組大鼠p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01);與模型組比較,各治療組大鼠p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01),其中以預(yù)防組效果最好;與預(yù)防組比較,其他各治療組大鼠p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p0.01)。各組大鼠ERK1/2蛋白表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示實(shí)驗(yàn)藥物可降低DN模型大鼠腎組織p-ERK1/2蛋白表達(dá),以預(yù)防組效果最好。結(jié)論:1.益氣解毒活絡(luò)方能夠改善DN大鼠的一般狀況,降低尿微量白蛋白的排泄,對(duì)早期DN大鼠的FBG、β2-MG均有明顯改善作用。2.益氣解毒活絡(luò)方防治早期DN的作用機(jī)制可能是通過降低AngⅡ水平,調(diào)節(jié)ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

圖 1 各組大鼠體質(zhì)量比較注：與正常組相比：**p＜0.01；與模型組相比：△p＜0.05；表 1 結(jié)果顯示，2 周（DN 成模）時(shí)，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異，無統(tǒng)差異（P＞0.05）；10 周（取材）時(shí)，與正常組比較，，模型組大鼠體質(zhì)量明

各組大鼠血糖比較
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號(hào)：2523237