【摘要】：目的本實(shí)驗(yàn)以“補(bǔ)元”思想理論為指導(dǎo),從“治未病”理念出發(fā),分別從細(xì)胞因子含量變化、關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變、軟骨細(xì)胞增殖與凋亡四個(gè)方面、不同角度與層次研究補(bǔ)元要藥人參的有效成分人參皂苷Rg1對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用,為中醫(yī)藥防治骨性關(guān)節(jié)炎提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。方法50只健康普通級(jí)新西蘭雄性大白兔,分成正常組、模型組、人參皂苷Rg1低、中、高劑量組,每組10只。除正常組外,其余4組兔采用左后肢管型石膏伸直位固定法制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。從造模第2天開始進(jìn)行藥物干預(yù)。人參皂苷Rg1低、中、高劑量組分別給予人參皂苷Rg15mg/kg、10mg/kg、20mg/kg灌胃給藥,正常組及模型組予以等劑量生理鹽水(5mL/kg)灌胃,每周3次,共6周。1.炎性細(xì)胞因子檢測:各組分別于造模前及干預(yù)結(jié)束后,在嚴(yán)格無菌操作條件下行左膝關(guān)節(jié)穿刺,注入生理鹽水1ml、反復(fù)抽吸多次使沖洗液混勻后抽取關(guān)節(jié)液,測定干預(yù)前后關(guān)節(jié)液中重要致炎因子白細(xì)胞介素1(IL-1)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量變化。2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:干預(yù)結(jié)束后在麻醉下用空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)兔,分別從大體肉眼觀、光鏡及透射電鏡(TEM)等方面,觀察各組兔膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)變化,并對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行Mankin評(píng)分。3.軟骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):取負(fù)重面關(guān)節(jié)軟骨,采用RT-PCR技術(shù)檢測軟骨細(xì)胞增殖周期關(guān)鍵調(diào)控因子Cyclin D1、P21 mRNA表達(dá)情況;Western-blot技術(shù)檢測Cyclin D1、P21蛋白表達(dá)情況;增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測及細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)分析軟骨細(xì)胞增殖活性,以研究人參皂苷Rg1對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。4.軟骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):取負(fù)重面關(guān)節(jié)軟骨,采用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子caspase-3、bax/bcl-2mrna表達(dá)情況;western-blot技術(shù)檢測caspase-3、bax/bcl-2蛋白表達(dá)情況,原位末端標(biāo)記法(tunel)觀察軟骨細(xì)胞凋亡率,以研究人參皂苷rg1對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果1.炎性細(xì)胞因子含量變化:干預(yù)前各組關(guān)節(jié)液內(nèi)no、il-1、tnf-α含量無明顯差異(p0.05),干預(yù)結(jié)束后模型組關(guān)節(jié)液內(nèi)no、il-1、tnf-α含量較干預(yù)前顯著提高(p0.01);人參皂苷rg1低、中、高劑量組no、il-1、tnf-α含量明顯低于模型組,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),且人參皂苷rg1中、高劑量組no、il-1、tnf-α含量低于人參皂苷rg1低劑量組(p0.05或p0.01)。人參皂苷rg1中、高劑量組相比,no、il-1、tnf-α含量差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.組織形態(tài)學(xué)變化:大體肉眼觀:正常組關(guān)節(jié)軟骨表面整齊光滑有彈性,無軟化及缺損;模型組關(guān)節(jié)軟骨呈灰黃色,磨損嚴(yán)重,彈性差,局部出現(xiàn)潰瘍,滑膜大量增生;人參皂苷rg1低劑量組關(guān)節(jié)軟骨呈黃色,關(guān)節(jié)表面略顯粗糙,無軟骨缺損,滑膜少量增生;人參皂苷rg1中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨表面尚光滑,無軟骨缺損。光鏡觀察:正常組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,四層結(jié)構(gòu)清晰有序,潮線完整;模型組關(guān)節(jié)軟骨層變薄,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)發(fā)生改變,排列混亂,裂隙深達(dá)輻射層,潮線破壞,番紅o染色重度減弱;人參皂苷rg1低劑量組關(guān)節(jié)軟骨層次基本完整,局部有表淺裂隙,潮線尚完整,番紅o染色輕、中度減弱;人參皂苷rg1中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨層次完整,軟骨表面尚光滑,排列輕度紊亂,潮線完整,番紅o染色輕度減弱。mankin評(píng)分:模型組評(píng)分最高,其余各組與模型組比較,差異有顯著性意義(p0.01),人參皂苷rg1中、高劑量組mankin評(píng)分低于人參皂苷rg1低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),但中、高劑量組兩組間比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。電鏡觀察:模型組軟骨細(xì)胞輪廓不清,外形不規(guī)則,細(xì)胞器腫脹甚至消失,核固縮,染色質(zhì)邊聚,甚至出現(xiàn)核分裂,凋亡小體形成;人參皂苷rg1低劑量組軟骨細(xì)胞輕度萎縮,輪廓尚清晰,胞漿內(nèi)細(xì)胞器輕度腫脹,胞核完整,核膜稍內(nèi)陷,染色質(zhì)分布輕度邊聚;人參皂苷Rg1中、高劑量組軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近于正常組。3.軟骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):人參皂苷Rg1低、中、高劑量組P21 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)均低于模型組(P0.05或P0.01),而CyclinD1 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)高于模型組(P0.05或P0.01),PCNA檢測顯示人參皂苷Rg1低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞增殖率明顯高于模型組(P0.01)。各項(xiàng)指標(biāo)中以中劑量組效果最佳。4.軟骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):模型組Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P0.01)及人參皂苷Rg1低、中、高劑量組(P0.05或P0.01);模型組Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于正常組(P0.01)及人參皂苷Rg1低、中、高劑量組(P0.05或P0.01)。Tunel法檢測顯示,低、中、高劑量組凋亡率顯著低于模型組(P0.01);中、高劑量組凋亡率無顯著差別(P0.05),但低于低劑量組(P0.05或P0.01)。各項(xiàng)指標(biāo)中以中劑量組效果最佳。結(jié)論1.伸直位管型石膏固定法造模6周,可成功建立類似臨床所見的人類骨關(guān)節(jié)炎模型。2.一定劑量人參皂苷Rg1可有效減少關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞因子NO、IL-1、TNF-α的含量,減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng),改善關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境。3.一定劑量人參皂苷Rg1可有效提高軟骨細(xì)胞G1期關(guān)鍵正向調(diào)節(jié)蛋白CyclinDl的表達(dá),抑制負(fù)向調(diào)控因子P21表達(dá),推動(dòng)軟骨細(xì)胞順利通過G1/S限制點(diǎn),進(jìn)入S期完成增殖周期,從而有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。4.一定劑量人參皂苷Rg1可通過調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Bax/Bcl-2表達(dá)比例、下調(diào)Caspase-3的表達(dá)來有效抑制軟骨細(xì)胞過度凋亡,避免軟骨組織進(jìn)行性破壞。
【圖文】：

圖 1 關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)分帶示意圖骨無血管、淋巴組織，，也沒有神經(jīng)支配[13]，其營養(yǎng)輸主要依賴關(guān)節(jié)內(nèi)滑液和滑膜血管滲透，通過彌散]，關(guān)節(jié)的痛覺及本體感覺主要依賴于滑膜、關(guān)節(jié)囊的神經(jīng)末稍傳導(dǎo)。關(guān)節(jié)軟骨的代謝活動(dòng)受多種生化康的關(guān)節(jié)軟骨處于一種合成與降解的精確動(dòng)態(tài)平衡壞,將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此健康的軟骨組織是機(jī)運(yùn)動(dòng)的保證。生發(fā)展伴隨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的退變[15],雖然目前對(duì)明確[16]，但從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究看,骨關(guān)節(jié)炎的病理特發(fā)生緩慢、漸進(jìn)性的退變。其病理改變始于軟骨，包括滑膜、關(guān)節(jié)囊、軟骨下骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨性變和軟骨下骨贅形成[17]。

軟骨組織的深處擴(kuò)展，直至裂縫到達(dá)軟骨下骨軟骨組織的厚度變薄，甚至軟骨全層消蝕。當(dāng)骼，刺激骨髓細(xì)胞遷移，發(fā)生炎癥反應(yīng)并且觸軟骨的骨組織。在關(guān)節(jié)表面、邊緣及軟骨下形來看，OA 早期關(guān)節(jié)軟骨有微小裂隙,局部可見斷裂,或出現(xiàn)雙重潮線。中期裂隙延伸至中、深骨細(xì)胞簇聚，細(xì)胞致密,電子密度增加，核膜模骨下骨的裂隙,表層不完整甚至缺失,軟骨下骨;細(xì)胞少,排列散亂,有大量簇聚軟骨細(xì)胞,潮線,膠原纖維排列紊亂，細(xì)胞的電子密度明顯增加,可見壞死或凋亡的軟骨細(xì)胞：核固縮、破裂，骨質(zhì)硬化、囊性變、骨贅形成,關(guān)節(jié)肥大變形心(圖 2)[18]。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2518989