發(fā)布時(shí)間：2019-07-11 14:44

【摘要】：目的:探討補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞增殖、成骨分化和凋亡的影響。材料與方法:Wistar大鼠,18只,雌雄各半,六周齡,體重200±20g,隨機(jī)分為三組:空白對(duì)照組,補(bǔ)腎健脾活血方組,二甲雙胍組,每組6只。根據(jù)等臨床劑量換算進(jìn)行灌胃給藥:空白對(duì)照組灌服蒸餾水,補(bǔ)腎健脾活血方組灌服補(bǔ)腎健脾活血方混懸液,二甲雙胍組灌服鹽酸二甲雙胍混懸液,每日灌胃1次,在第7d給藥2h后,腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血,靜置2h后,離心(2500rpm,4℃,20min),收集血清,同組混勻,56℃水浴滅活30min,經(jīng)濾膜過濾后分裝,-86℃保存。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、高糖組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、二甲雙胍組。采用CCK-8法,篩選葡萄糖對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞干預(yù)的最適劑量和檢測(cè)各組成骨細(xì)胞增殖率;對(duì)硝基苯磷酸鹽法(PNPP)檢測(cè)各組堿性磷酸酶(ALP)活性;ELISA法檢測(cè)骨鈣素(OC)含量;流式細(xì)胞術(shù)Anexin-V/PI雙染法檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率;蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)(Western-blot)檢測(cè)成骨分化相關(guān)蛋白BMP2和Runx2的表達(dá)和凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)檢測(cè)BMP2、Runx2、Bax和Bcl-2 m RNA的表達(dá)。結(jié)果:1.不同濃度葡萄糖對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖抑制率的影響與空白對(duì)照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)24h和48h,葡萄糖濃度為25 mmol/L和33 mmol/L組細(xì)胞的抑制率均顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí),葡萄糖濃度為16.7mmol/L、25 mmol/L和33 mmol/L組細(xì)胞的抑制率均升高(p0.01或p0.05)。2.補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響與空白對(duì)照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h和72h,高糖組細(xì)胞增殖能力均顯著降低(p0.01);與高糖組比較,細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h,中藥低劑量組細(xì)胞增殖能力升高(p0.05),細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h和72h,中藥中、高劑量組和二甲雙胍組細(xì)胞增殖能力顯著升高(p0.01);與二甲雙胍組比較,細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h和72h,中藥低、高劑量組細(xì)胞增殖能力顯著降低(p0.01);與中藥低劑量組比較,細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h和72h,中藥中劑量組細(xì)胞增殖能力顯著升高(p0.01)。3.補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響3.1補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響與空白對(duì)照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)1d、3d、5d、7d,高糖組細(xì)胞ALP活性均顯著降低(p0.01);與高糖組比較,細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d、7d,中藥低劑量組細(xì)胞ALP活性升高(p0.05或p0.01),細(xì)胞培養(yǎng)1d、3d、5d、7d,中藥中、高劑量組和二甲雙胍組細(xì)胞ALP活性顯著升高(p0.05或p0.01);與二甲雙胍組比較,細(xì)胞培養(yǎng)1d、3d、5d、7d,中藥低劑量組細(xì)胞ALP活性降低(p0.05或p0.01),其他各組無顯著性差異(p0.05);與中藥低劑量組比較,細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d、7d,中藥中劑量組ALP活性顯著升高(p0.01)。3.2補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞上清液OCN的影響與空白對(duì)照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d、7d、14d,高糖組細(xì)胞骨鈣素的分泌均顯著降低(p0.01);與高糖組比較,細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d、7d、14d,中藥中、高劑量組和二甲雙胍組細(xì)胞骨鈣素分泌能力均顯著升高(p0.01);與二甲雙胍組比較,細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d、7d、14d,中藥低劑量組細(xì)胞骨鈣素分泌能力顯著降低(p0.01),細(xì)胞培養(yǎng)5d、7d、14d,中藥高劑量組骨鈣素分泌能力降低(p0.05或p0.01);與中藥低劑量組,細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d、7d、14d,中藥中、高劑量組骨鈣素分泌能力顯著增高(p0.01)。3.3補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞BMP2、Runx2蛋白表達(dá)的影響藥物干預(yù)48h后,與空白對(duì)照組比較,高糖組的BMP2、Runx2蛋白表達(dá)均顯著減少(p0.01);與高糖組比較,中藥低、中、高劑量組和二甲雙胍組的BMP2、Runx2蛋白表達(dá)量均有所增加(p0.05或p0.01);與二甲雙胍組比較,中藥低、中、高劑量組的BMP2蛋白表達(dá)均顯著減少(p0.01),中藥低、中劑量組的Runx2蛋白表達(dá)減少(p0.05);與中藥低劑量比較,中藥中、高劑量組的BMP2、Runx2蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.4補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞BMP2 m RNA、Runx2 m RNA表達(dá)的影響藥物干預(yù)48h后,與空白對(duì)照組比較,高糖組的BMP2、Runx2基因表達(dá)均顯著減少(p0.01);與高糖組比較,中藥低、中、高劑量組、二甲雙胍組對(duì)BMP2、Runx2基因表達(dá)均有一定程度的增加(p0.05或p0.01);與二甲雙胍組比較,中藥低、中、高劑量組對(duì)BMP2基因表達(dá)均顯著減少(p0.01),中藥低、中劑量組的Runx2基因表達(dá)均減少(p0.05或p0.01);與中藥低劑量組比較,中藥高劑量組對(duì)Runx2基因表達(dá)顯著增加(p0.01)。4.補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞凋亡的影響4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡與空白對(duì)照組比較,高糖組細(xì)胞凋亡率顯著增高(p0.01);與高糖組比較,中藥低、中、高劑量組、二甲雙胍組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低(p0.01);與二甲雙胍組比較,中藥低、高劑量組細(xì)胞凋亡率增高(p0.05或p0.01);與中藥低劑量組比較,中藥中劑量組細(xì)胞早期凋亡率顯著減少(p0.01)。4.2補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較,高糖組Bcl-2/Bax的比值顯著減少(p0.01);與高糖組比較,中藥低、中、高劑量組、二甲雙胍組Bcl-2/Bax的比值增加(p0.05或p0.01);與二甲雙胍組比較,中藥高劑量組Bcl-2/Bax的比值顯著增加(p0.01),中藥低、中劑量組均顯著減少(p0.01);與中藥低劑量組比較,中藥高劑量組Bcl-2/Bax比值顯著增加(p0.01)。4.3補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞Bax、Bcl-2 m RNA表達(dá)的影響藥物干預(yù)48h后,與空白對(duì)照組比較,高糖組Bcl-2/Bax的比值顯著減少(p0.01);與高糖組比較,中藥低、中、高劑量組、二甲雙胍組Bcl-2/Bax的比值顯著增加(p0.01);與二甲雙胍組比較,中藥高劑量組Bcl-2/Bax的比值增加(p0.05),中藥低、中劑量組均顯著減少(p0.01);與中藥低劑量組比較,中藥高劑量組Bcl-2/Bax比值顯著增加(p0.01)。結(jié)論:1.補(bǔ)腎健脾活血方能促進(jìn)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞的增殖與分化。2.補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞凋亡有抑制作用。
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圖片說明： 葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞增殖抑制率的影響表 1-2 和圖 1-2，從表 1-2 和圖 1-2 可以看出，與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞，葡萄糖濃度為 25 mmol/L 和 33 mmol/L 組細(xì)胞的抑制率均顯著升高，＜0.01)，細(xì)胞培養(yǎng) 72h，葡萄糖濃度為 16.7mmol/L、25 mmol/L 和 33 m制率均升高(p＜0.01 或 p＜0.05)。表 1-2 各組不同時(shí)間段 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖抑制率的影響（x s）組別 24h 48h 72h空白對(duì)照組 0.532±0.038 0.865±0.046 1.165±0.04616.7mmol/L 0.491±0.022 0.825±0.018 1.05±0.035*25mmol/L 0.34±0.0265**0.640±0.026**0.84±0.026**33mmol/L 0.206±0.015**0.506±0.015**0.706±0.015**空白對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01
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圖片說明： 補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下 MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化及凋亡的作用劑量組和二甲雙胍組細(xì)胞增殖能力顯著升高(p＜0.01)；與二甲雙胍組比較h、48h 和 72h，中藥低、高劑量組細(xì)胞增殖能力顯著降低(p＜0.01)；與中較，細(xì)胞培養(yǎng) 24h、48h 和 72h，中藥中劑量組細(xì)胞增殖能力顯著升高(p 1-3 補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞增殖能力的影響（x s）組別 24h 48h 72h空白對(duì)照組 0.597±0.038 0.696±0.041 0.799±0.06高糖組 0.418±0.017**△△0.518±0.019**△△0.7±0.025*△△中藥低劑量組 0.457±0.016★△△0.556±0.013★△△0.659±0.021★△△中藥中劑量組 0.559±0.021★★##0.666±0.027★★##0.768±0.059★★##中藥高劑量組 0.483±0.015★★△△0.582±0.011★★△△0.684±0.035★★△△二甲雙胍組 0.561±0.016★★0.661±0.031★★0.779±0.061★★，與空白對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01；與高糖組比較，★p<0.05，★★p<0.01；，，△△p<0.01；與中藥低劑量組比較，#p<0.05，##p<0.01
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 李穎;黃宏興;姜志強(qiáng);;補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方干預(yù)成骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡蛋白的機(jī)制研究[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2016年11期

2 陳水昌;李穎;盧國森;;補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GADD34、ERO1、IRE-1干預(yù)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J];山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年05期

3 王芳;高英;李衛(wèi)民;陳s

本文編號(hào)：2513239