發(fā)布時(shí)間：2019-06-08 07:37

【摘要】：目的： 清開靈注射液發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)時(shí),常用抗過敏藥物異丙嗪來進(jìn)行治療。已有臨床前及臨床數(shù)據(jù)研究證明,清開靈能導(dǎo)致潛在的心律失常,本研究對(duì)抗過敏藥物異丙嗪用于搶救清開靈注射液引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)患者的方案提出了質(zhì)疑,通過臨床前的心臟安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證異丙嗪可加重清開靈注射液所致的緩慢性心律失常作用。 藥品： 1.清開靈：清開靈注射液(QKL),批號(hào)：11040664,國(guó)藥準(zhǔn)字Z13020880,河北神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。 2.異丙嗪：異丙嗪鹽酸鹽(Promethazine, PMZ),批號(hào)：1001154582,是從Sigma-aldrich公司購買。 方法： 1.豚鼠在體心電圖記錄： 20%烏拉坦(5mL/kg)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉,以仰臥位進(jìn)行固定,分離出一側(cè)頸靜脈,進(jìn)行插管,再給藥。四肢皮下扎入針形電極引導(dǎo)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電信號(hào),經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計(jì)算機(jī)。于靜脈推注藥物5min后記錄心電圖,分析心率、P-R間期、QRS間期和QTc間期。 按照清開靈注射液說明書所規(guī)定的：成人用量為每次40ml,在體實(shí)驗(yàn)采用40ml為1倍臨床劑量。按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)豚鼠用劑量為人用劑量的4.6倍,換算為豚鼠在體1倍劑量為3.1ml/kg。按照注射用異丙嗪鹽酸鹽說明書所規(guī)定的：抗過敏用量每次25mg,最高量不得超過每次100mg,在體實(shí)驗(yàn)中采用臨床最高用量100mg/60kg為1倍臨床劑量。同樣按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)換算為豚鼠在體1/2倍劑量為3.83mg/kg,1倍劑量為7.67mg/kg,2倍劑量為15.33mg/kg,5倍劑量為38.35mg/kg。 2.豚鼠離體心電圖記錄： 采用改進(jìn)的Langendoff灌流系統(tǒng),經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行離體心臟灌流,心臟復(fù)跳后在心外膜下置3根銀絲電極：正極置于心尖處,負(fù)極置于右心房,接地電極置于主動(dòng)脈根部,引導(dǎo)出離體心臟心電圖。待豚鼠心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后,信號(hào)經(jīng)四道生理記錄儀輸入計(jì)算機(jī)記錄,分析心率、P-R間期、QRS間期和QTc間期。 清開靈注射液的說明書規(guī)定成人用量為40m1。按成人體重60kg為例計(jì)算；成人細(xì)胞外液約為12000ml(按體重的20%算),因此換算成臨床血藥濃度即為3.3ml/L。據(jù)上述方法換算后,離體實(shí)驗(yàn)的組織和細(xì)胞灌流液1倍臨床濃度為3.3ml/L,10倍臨床濃度為33ml/L。根據(jù)之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)可得知,單獨(dú)異丙嗪實(shí)驗(yàn),采用的濃度為0.1、1、10和50μmol/L,與清開靈合用時(shí)采用1、10、30和50μmol/L。 3.豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位記錄： 用20%烏拉坦(5mL/kg)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后,快速開胸取出心臟,置于0-4℃無鈣灌流液中使之停搏,修剪,取出左心室乳頭肌1條,將其固定于恒溫浴槽底部。充以95%02+5%CO2飽和的含鈣臺(tái)氏灌流液,在恒溫(36±0.5℃)下以5ml/min的速度恒速灌流,標(biāo)本在浴槽內(nèi)穩(wěn)定1小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給予強(qiáng)度為1.5倍閾值,波寬10ms,刺激頻率1Hz的方波刺激。信號(hào)經(jīng)四道生理記錄儀輸入計(jì)算機(jī)記錄。 4.大鼠左心室肌細(xì)胞L型鈣電流記錄： 采用改良的酶解法分離獲取大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞。采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法,在室溫(20-22℃)下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液數(shù)滴加入倒置顯微鏡上的灌流槽中(RC-26,Recording Chamber150μL, USA),細(xì)胞貼壁后,用電流記錄外液灌流。選取邊緣無卷曲,橫紋清晰,表面無顆粒,無收縮的細(xì)胞進(jìn)行封接實(shí)驗(yàn)。玻璃毛細(xì)管(Sutter instrument O.D.1.5mm, I.D.1.1mm with filament)經(jīng)微電極拉制儀制成尖端直徑約為1μm的電極,電極充灌電流記錄內(nèi)液后,入水阻抗約為5MΩ。調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細(xì)胞表面進(jìn)行封接,阻抗達(dá)到1GΩ以上后補(bǔ)償快電容,并給予負(fù)壓破膜形成全細(xì)胞記錄模式,調(diào)節(jié)慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償,以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗制電位誤差。鉗制電壓為-80mV,階躍到-40mV并維持200ms(使Na+電流失活),然后施加到0mV、300ms的試驗(yàn)電壓。在電壓鉗制模式下,記錄用藥前后L型鈣通道的變化。 無鈣灌流液mmol/L):NaCl117, KCl5.7, NaHCO34.4, NaH2PO41.5, MgCl21.7, HEPES20, Glucose20, Taurine10, pH用NaOH調(diào)至7.4。 KB液組成為為;mmol/L):L-glutamic acid50, KCl40, KH2PO420, Taurine20, MgCl2-6H2O3, KOH70, EGTA0.5, HEPES10, Glucose10. pH用NaOH調(diào)至7.4。 電極記錄外液組成為I;mmol/L):NaCl132, CsCl5.4, CaCl21.8, MgCl2-6H2O1.8, NaH2PO·2H2O0.6,4AP5, HEPES10, glucose-H2O10, Na-pyruvate5. pH用NaOH調(diào)至7.4。 電極記錄內(nèi)液組成為(mmol/L):CsCl130, MgCl2·6H2O2, EGTA11, HEPES20, glucose-H2O10, Na2ATP2, GTP0.1.pH用NaOH調(diào)至7.4。 5.全細(xì)胞電壓鉗記錄hNav1.5電流： 合成的hNav1.5cDNA(NM_000335.4)被克隆到帶有G418耐藥性表達(dá)載體pcDNA3.1。構(gòu)成的質(zhì)粒在脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑作用下,轉(zhuǎn)染至HEK (human embryo kidney)細(xì)胞系中。在Dulbecco's改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基上培養(yǎng)(10%小牛血清和250μg/mlG418) hNav1.5細(xì)胞株,通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)用于hNav1.5電流記錄。 采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法,在室溫(20-22℃)下進(jìn)行。 鉗制電壓為-80mV,階躍到-20mV維持20ms。電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大并經(jīng)數(shù)字-信號(hào)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)對(duì)話,信號(hào)的發(fā)放和采集均由pClamp10.0軟件完成。 記錄外部溶液(mmol/L):NaCl25、TEAC1122、MgC121、Glucose10、HEPES10、 CaC121.8, pH用NaOH調(diào)至7.4,滲透壓值用sucrose調(diào)至290mOsm。 記錄內(nèi)部溶液(mmol/L):CsF129、MgC122、EGTA11、HEPES10、Na2ATP3、pH用CsOH調(diào)至7.2,滲透壓值用sucrose調(diào)至290mOsm。 6.全細(xì)胞電壓鉗記錄hERG電流： 合成的hERG cDNA (NM_000238.2)被克隆到帶有G418耐藥性表達(dá)載體pcDNA3.1。構(gòu)成的質(zhì)粒在脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑作用下,轉(zhuǎn)染HEK (human embryo kidney)細(xì)胞系中。在Dulbecco's改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基上培養(yǎng)(10%小牛血清和250μg/ml G418)hERG細(xì)胞株,通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)用于hERG電流記錄。 采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法,在室溫(20-22℃)下進(jìn)行。鉗制電壓為-80mV,階躍到-50mV維持50ms,然后施加到50mV4800ms試驗(yàn)電壓,最后施加到-50mV5000ms試驗(yàn)電壓。電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大并經(jīng)數(shù)字-信號(hào)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)對(duì)話,信號(hào)輸入經(jīng)過1kHz的濾波,信號(hào)的發(fā)放和采集均由pClamp10.0軟件完成。 結(jié)果： 1.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)豚鼠在體心電圖的影響： 清開靈注射液在3.1ml/kg和15.5ml/kg時(shí),對(duì)豚鼠在體心電圖的P-R、QRS、QTc間期及心率(P0.05)未能有顯著改變；在清開靈注射劑31ml/kg和93ml/kg時(shí),呈劑量依賴性的延長(zhǎng)豚鼠的QRS間期及QTc間期,而且清開靈注射液93ml/kg時(shí)還能顯著性地延長(zhǎng)P-R間期(P0.05)。對(duì)于異丙嗪而言,3.83mg/kg(1/2臨床劑量)和7.67mg/kg(1倍臨床劑量)沒有明顯改變豚鼠在體心電圖的心率、P-R、QRS以及QTc間期(P0.05)；異丙嗪15.33mg/kg(2倍臨床劑量)顯著的延長(zhǎng)了QRS間期；異丙嗪38.35mg/kg(5倍臨床劑量),顯著減慢心率以及延長(zhǎng)P-R、QRS以及QTc間期。清開靈注射劑31ml/kg時(shí)能顯著延長(zhǎng)豚鼠心電圖的QRS間期以及QTc間期,當(dāng)清開靈注射劑31ml/kg合用異丙嗪38.35mg/kg劑量時(shí),能進(jìn)一步延長(zhǎng)清開靈注射液以及清開靈注射液合用7.67ml/kg作用下的P-R、QRS以及QTc間期,而且對(duì)豚鼠心率有顯著性減慢的作用(P0.05)。 2.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)豚鼠離體心電圖的影響： 33ml/L的清開靈注射液顯著地延長(zhǎng)QRS間期(P0.05)；清開靈注射劑在66和99ml/L時(shí)顯著減慢心率并顯著延長(zhǎng)P-R, QRS間期(P0.05),而且在99ml/L時(shí)還能顯著延長(zhǎng)其QTc間期(P0.05)。對(duì)于異丙嗪而言,濃度為10μmol/L時(shí)明顯減慢離體豚鼠心臟心率(P0.05)及延長(zhǎng)QRS間期；50μmol/L的異丙嗪能明顯減慢豚鼠心臟心率而且顯著延長(zhǎng)QRS間期和QTc間期(P0.05)。當(dāng)選用33ml/L清開靈注射液作為基礎(chǔ)濃度,再合用1、10、30、50μmol/L的異丙嗪,心率出現(xiàn)不同程度濃度依賴性減慢,還進(jìn)一步延長(zhǎng)了清開靈作用下的P-R間期、QTc以及QRS間期(P0.05)。再用清開靈33ml/L進(jìn)行洗脫后,各參數(shù)會(huì)出現(xiàn)部分恢復(fù)。 3.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響： 單獨(dú)灌流99μl/ml的清開靈注射液,豚鼠的左心室乳頭肌的動(dòng)作電位未見消失,而濃度達(dá)到165μl/ml時(shí)動(dòng)作電位部分消失。對(duì)于異丙嗪而言,濃度為26μmol/L時(shí),未出現(xiàn)動(dòng)作電位消失。而當(dāng)清開靈注射液99μl/ml合并異丙嗪10μmol/L時(shí),動(dòng)作電位就能出現(xiàn)部分的消失。同時(shí)再進(jìn)行灌流液洗脫后,發(fā)現(xiàn)動(dòng)作電位又可以恢復(fù)到正常。這就表明異丙嗪和清開靈注射液合用時(shí),是加重了清開靈注射液抑制動(dòng)作電位的形成。 4.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)大鼠左心室肌細(xì)胞L型鈣電流的影響： 清開靈注射液呈劑量依賴性的阻滯大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流,抑制其L型鈣電流50%濃度(IC50)為52.2±10.9ml/L。異丙嗪對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞的L型鈣電流也有抑制作用,抑制其的50%濃度(IC50)是9.2±1.3μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3ml/L存在的條件下,抑制大鼠L型鈣電流50%濃度(IC50)為7.0±1.0μmol/L,兩組之間存在顯著性差異。 5.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)hNav1.5電流的影響： 異丙嗪濃度依賴性地抑制了]hNavl.5電流,其IC5o為6.4±1.4μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3ml/L存在條件下,抑制hNavl.5電流50%濃度(IC5o)為4.0±0.4μmol/L,兩組之間存在顯著性差異。 6.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)hERG電流的影響： 異丙嗪可計(jì)量依賴性的阻滯hERG電流,抑制hERG電流50%的濃度(IC50)為1.6±0.2μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3ml/L存在的條件下,其抑制hERG電流50%濃度(IC5o)為1.0±0.2μmol/L,兩組之間存在顯著性差異。 結(jié)論： 1.豚鼠心臟的在體和離體實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_證清開靈注射液能穩(wěn)定的誘發(fā)緩慢性心律失常。 2.在豚鼠心臟的在體實(shí)驗(yàn)中,異丙嗪有減慢其心律失常的作用。在離體乳頭肌的實(shí)驗(yàn)中可以使動(dòng)作電位部分消失。同時(shí)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流、hNav1.5以及hERG電流都呈濃度依賴性的抑制,其IC50分別為9.2±1.3μmol/L、6.4±1.4μmol/L、1.6±0.2μmol/L. 3.異丙嗪與清開靈注射液的合用并沒有起到救治作用,反而加重了清開靈注射液減慢心率以及顯著延長(zhǎng)P-R間期以及QRS間期和QTc間期的作用,進(jìn)一步加重清開靈致緩慢性心律失常的作用。 4.異丙嗪在清開靈3.3ml/L的存在條件下,對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流、hNavl.5以及hERG電流都呈濃度依賴性的抑制,IC50分別為7.0±1.0μmol/L、4.0±0.4μmol/L、1.0±0.2μmol/L。通過比較可知二者合用增強(qiáng)了對(duì)hNav1.5和L型鈣電流的抑制作用,也就是異丙嗪加重清開靈致心律失常的作用機(jī)制之一。在清開靈和異丙嗪合用時(shí),hERG電流也出現(xiàn)了抑制,但在豚鼠動(dòng)作電位的實(shí)驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出明顯的延長(zhǎng)作用,這可能是它們同時(shí)抑制了L型鈣電流以及hERG電流的一個(gè)綜合表現(xiàn)。
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【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 何守再;清開靈注射液致急性左心衰2例[J];臨床薈萃;1996年02期

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本文編號(hào)：2495116