【摘要】：目的：本研究從內(nèi)皮細胞的胰島素受體底物-2/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號途徑以及還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4-活性氧-不對稱二甲基精氨酸系統(tǒng)兩個通路入手，采用細胞培養(yǎng)、生化檢測試劑盒、RT-PCR和Western blot等技術手段，探討并觀察經(jīng)典方劑六味地黃丸含藥血清對高濃度軟脂酸所致血管內(nèi)皮細胞功能損傷的保護作用，從細胞及分子水平揭示其作用機制，尋找防治糖尿病及血管病變的新靶點，為六味地黃丸治療糖尿病及并發(fā)癥提供理論基礎及實驗依據(jù)，并建立新的研究平臺。 材料與方法： 論文一：①六味地黃丸含藥血清的制備。將52只SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠按隨機數(shù)字法分為正常對照組和六味地黃丸（liuweidihuang pill，LWDHP）中藥組，中藥組給予六味地黃丸粉末水溶液（生藥質(zhì)量濃度為15g/kg·d）灌胃，正常對照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃6d。然后施行10%水合氯醛腹腔麻醉，于腹主動脈采血，室溫下血液自然凝固，離心后分離血清，56℃水浴滅活，過濾除菌，分裝封口，-80℃保存?zhèn)溆�。②EA.hy926人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vascular endothelialcells，HUVEC）的培養(yǎng)及細胞模型的建立。EA.hy926HUVEC于37℃，5%CO2的孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2d換液1次，3～4d傳代1次。取對數(shù)生長期的EA.hy926HUVEC，調(diào)整密度為0.5×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，，200μL/孔，設定正常對照組和5個不同濃度梯度的軟脂酸（palmitic acid，PA）組，每組6個復孔。待細胞90%生長融合后，加入PA使終濃度為200μmol/L，300μmol/L，400μmol/L，500μmol/L，600μmol/L，孵育1h后，再加入胰島素使其終濃度為50nmol/L。PA作用24h誘導內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）損傷后，加入濃度為5mg/mL的MTT20μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)作用4h，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）150μL震蕩細胞15min，于酶標儀（波長490nm）檢測光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖率約為正常對照組的50%～60%，與正常對照組比較有顯著性差異，即可篩選出PA造模的最佳濃度，形成細胞損傷模型用于后續(xù)實驗。③六味地黃丸含藥血清對PA損傷的EA.hy926HUVEC增殖的影響。取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分為正常對照組，模型組（PA終濃度為400μmol/L），六味地黃丸中藥治療組（2.5%、5%、10%、20%含藥血清），二甲雙胍（metformin，MET）組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸中藥治療組換成不同濃度梯度的含2.5%、5%、10%、20%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET使其終濃度2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)干預保護24h。模型組、六味地黃丸組及MET組各加入PA作用1h后，再加入胰島素使其終濃度50nmol/L。PA作用24h后，即刻鏡下觀察各組細胞生長的形態(tài)特征，隨后加入MTT作用4h，加DMSO震蕩細胞15min，于490nm波長檢測OD值，計算細胞增殖率為正常對照組的70%～80%，六味地黃丸組與模型組比較有顯著性差異，即可舍棄掉不理想濃度的六味地黃丸含藥血清，余下的濃度梯度用于后續(xù)實驗。 論文二：①細胞培養(yǎng)基中一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的檢測。取對數(shù)生長期的EA.hy926HUVEC接種培養(yǎng)，分為正常對照組，模型組，六味地黃丸中藥組（2.5%、5%、10%含藥血清），MET組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸治療組換成不同濃度梯度的含2.5%、5%、10%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入PA和胰島素24h后，各組分別收集培養(yǎng)基按照檢測試劑盒的說明進行操作，于540nm測定OD值，檢測NO含量。協(xié)助篩選出最佳的六味地黃丸含藥血清濃度，用于后續(xù)實驗。②RT-PCR測定細胞胰島素受體底物-2（insulin receptor substrate-2，IRS-2），磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy linositide-3kinase，PI3K），蛋白激酶B（proteinkinases B，PKB/Akt），內(nèi)皮源型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）mRNA的表達。調(diào)整細胞密度為4×105個/mL接種到25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加4mL培養(yǎng)基，分為正常對照組，模型組，5%六味地黃丸含藥血清治療組，MET組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸治療組換成含5%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入PA和胰島素24h后，棄去培養(yǎng)基，收集細胞，提取細胞總RNA，用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應。凝膠成像系統(tǒng)分析電泳圖像，以各組樣本目的基因條帶光密度值和對應的β-actin條帶光密度值的比值表示各目的基因mRNA的表達量。③Western blot測定細胞IRS-2，PI3K，P-Akt，eNOS蛋白表達。調(diào)整細胞密度為5×105個/mL接種到25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加5mL培養(yǎng)基，分為正常對照組，模型組，5%六味地黃丸含藥血清治療組，MET組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸治療組換成含5%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入PA和胰島素24h后，棄去培養(yǎng)基，收集細胞，提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣本蛋白濃度，調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量（55μg），進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。掃描條帶，軟件分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，各組目的蛋白表達強度和內(nèi)參GAPDH蛋白表達強度進行比值顯示各組目的蛋白表達水平。 論文三：①檢測細胞裂解上清液中丙二醛（malonyldialdehyde MDA）含量、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及細胞培養(yǎng)基中不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）濃度。取對數(shù)生長期的EA.hy926HUVEC接種培養(yǎng)，分為正常對照組，模型組，六味地黃丸中藥組（2.5%、5%、10%含藥血清），MET組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸治療組換成不同濃度梯度的含2.5%、5%、10%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入PA和胰島素24h后，各組分別收集培養(yǎng)基和細胞，按照各自的檢測試劑盒的說明進行操作，于532nm、560nm、450nm測定OD值，分別檢測MDA含量、總SOD活性、ADMA濃度。最終篩選出最佳的六味地黃丸含藥血清濃度，用于后續(xù)實驗。②RT-PCR測定細胞還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-4，NOX4），蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（protein arginine methyltransferase-1，PRMT1），二甲基精氨酸二甲胺水解酶2（dimethylarginine dimethylaminohydrolase-2，DDAH2）mRNA的表達。調(diào)整細胞密度為4×105個/mL接種到25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加4mL培養(yǎng)基，分為正常對照組，模型組，5%六味地黃丸含藥血清治療組，MET組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸治療組換成含5%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入PA和胰島素24h后，棄去培養(yǎng)基，收集細胞，提取細胞總RNA，用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應。凝膠成像系統(tǒng)分析電泳圖像，以各組樣本目的基因條帶光密度值和對應的β-actin條帶光密度值的比值表示各目的基因mRNA的表達量。③Western blot測定細胞NOX4、PRMT1、DDAH2蛋白的表達。調(diào)整細胞密度為5×105個/mL接種到25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加5mL培養(yǎng)基，分為正常對照組，模型組，5%六味地黃丸含藥血清治療組，MET組。待細胞90%生長融合后，六味地黃丸治療組換成含5%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入PA和胰島素24h后，棄去培養(yǎng)基，收集細胞，提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣本蛋白濃度，調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量（55μg），進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、DAB顯色。掃描條帶，軟件分析，以GAPDH作為內(nèi)參，各組目的蛋白表達強度和內(nèi)參GAPDH蛋白表達強度進行比值顯示各組目的蛋白表達水平。 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x s）表示，使用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析后進行組間LSD分析。P＜0.05，認為有顯著性差異，P＜0.01有極顯著性差異。 結果： 1. PA最佳造模濃度的篩選。不同濃度梯度（200μmol/L，300μmol/L，400μmol/L，500μmol/L，600μmol/L）的PA作用EA.hy926細胞后，OD值和細胞增殖率逐漸下降，與正常對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01），選取使細胞增殖率為50.48%時的PA濃度400μmol/L為細胞造模的最佳濃度。 2.各組細胞形態(tài)特征的觀察。正常對照組的細胞為扁平多角形或梭形，邊界清楚，呈單層鋪路石狀鑲嵌排列。PA組細胞收縮變形成多星狀形或橢圓形，連接斷裂分離，輪廓不清，胞漿內(nèi)有暗色顆粒。2.5%六味地黃丸含藥血清組的細胞數(shù)量少，密度低；5%含藥血清組的細胞數(shù)量和形態(tài)接近正常對照組；10%含藥血清組的細胞數(shù)量和密度加大，高于正常對照組；20%含藥血清組的細胞數(shù)量和密度幾乎接近5%含藥血清組。MET組的細胞接近正常對照組。 3.六味地黃丸含藥血清對EA.hy926HUVEC增殖率的影響。用不同濃度的六味地黃丸含藥血清對細胞進行干預保護，2.5%六味地黃丸含藥血清組的細胞增殖率只有31.67%；5%、10%及20%含藥血清組細胞增殖率分別為77.46%、130.87%及85.86%，均明顯高于模型組（P＜0.01）；20%含藥血清的增殖率與5%含藥血清的增殖率比較，沒有顯著性差異（P＞0.05），因此可初步篩選出5%六味地黃丸含藥血清作為最佳的治療濃度。 4. PA損傷的細胞培養(yǎng)基中NO含量減少，與正常對照組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。2.5%六味地黃丸含藥血清組NO含量進一步減少；5%、10%六味地黃丸含藥血清組及MET組均能顯著增加細胞培養(yǎng)基中NO含量，與PA組比較有顯著性差異（P＜0.01），但三者之間互相比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。 5.模型組細胞內(nèi)IRS-2，PI3K，Akt，eNOS mRNA和蛋白的表達量顯著減少，與正常對照組比，有顯著性差異（P＜0.01）。5%六味地黃丸含藥血清組和MET組細胞內(nèi)IRS-2，PI3K，Akt，eNOS mRNA和蛋白表達量增加，與模型組比，差異顯著（P＜0.01），意味著六味地黃丸干預保護后可以促進PA誘導損傷的EA.hy926細胞內(nèi)IRS-2，PI3K，Akt，eNOS mRNA和蛋白的表達。 6. PA損傷的細胞裂解液中MDA含量增高，總SOD活性顯著下降，細胞培養(yǎng)基中ADMA含量明顯增高，正常對照組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。2.5%六味地黃丸含藥血清組的MDA含量稍降低，與模型組比較有差異（P＜0.05），ADMA含量降低不明顯，與模型組比較沒有差異（P＞0.05），總SOD活性與模型組比較幾乎沒有變化，沒有差異（P＞0.05）。5%和10%六味地黃丸含藥血清和MET能顯著降低MDA含量和ADMA含量，增加總SOD活性，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）。 7.與正常對照組比，PA組細胞內(nèi)NOX4和PRMT1mRNA和蛋白的表達量顯著升高（P＜0.01），DDAH2mRNA和蛋白的表達量顯著降低（P＜0.01）。與PA組比，5%六味地黃丸含藥血清組和MET組細胞內(nèi)NOX4和PRMT1mRNA和蛋白的表達量明顯下降（P＜0.01），DDAH2mRNA和蛋白表達量明顯升高（P＜0.01）。 結論： 1. PA對EA.hy926HUVEC有非常強烈的毒性作用，采用PA模擬建立胰島素抵抗（insulinresistance，IR）細胞模型獲得成功而且造模穩(wěn)定。 2.六味地黃丸含藥血清能促進PA損傷的EA.hy926HUVEC增殖，增加細胞的增殖率。 3.六味地黃丸含藥血清組的細胞損傷有明顯的減輕，說明其對EC具有明顯的保護作用。 4.六味地黃丸含藥血清能夠增加PA損傷的EA.hy926細胞培養(yǎng)基中NO的含量，同時也促進eNOS mRNA和蛋白的表達，提示六味地黃丸干預保護后通過eNOS mRNA和蛋白的表達有效促進NO的合成，從而發(fā)揮其保護作用。 5.六味地黃丸含藥血清能夠促進EC中IRS-2，PI3K，Akt mRNA和蛋白的表達量，意味著通過IRS-2/PI3K/Akt途徑進一步增加eNOS mRNA和蛋白的表達及NO的合成，從而保護受損細胞，改善和糾正IR。 6.六味地黃丸含藥血清能顯著降低PA損傷HUVEC的MDA含量，增加總SOD活性，同時能下調(diào)受損細胞的NOX4mRNA和蛋白表達，證明六味地黃丸能降低PA對HUVEC的氧化損傷程度，增強抗氧化酶的活性，改善受損的EC狀態(tài)，提示六味地黃丸可能通過抑制NOX4的表達進而發(fā)揮它的抗氧化功效。 7.六味地黃丸含藥血清能引起PRMT1表達明顯下降，DDAH2表達明顯升高，從而顯著降低ADMA含量，證明六味地黃丸也可以通過其抗氧化保護作用，在一定程度上調(diào)節(jié)PRMT1-DDAH2-ADMA的表達，抑制氧化應激反應，改善氧化應激損傷。 8.進一步提示六味地黃丸通過PI3K/Akt途徑增加NO含量來保護EC與調(diào)節(jié)NOX4-ROS（MDA）及PRMT1-DDAH2-ADMA通路有著密切關系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2480431