【摘要】：研究背景 阿片類藥物在治療各種傷害性刺激（手術(shù)、創(chuàng)傷等急性疼痛，各種慢性疼痛）的同時會帶來許多不良反應(yīng)，，如藥物依賴，耐受，成癮及阿片藥物誘導(dǎo)痛覺過敏（Opioid induced hyperalgesia,OIH）等。急性O(shè)IH被IASP定義為“基于阿片樣物質(zhì)的麻醉和手術(shù)后的疼痛感知增加”。瑞芬太尼是超短效的μ-阿片受體激動劑被廣泛應(yīng)用于全身麻醉中的鎮(zhèn)痛,其產(chǎn)生痛覺過敏的發(fā)生率明顯高于其他阿片類藥物。研究表明中樞系統(tǒng)NMDA受體功能和數(shù)量的改變在瑞芬太尼痛覺過敏的形成過程中發(fā)揮了重要的作用,但目前針對脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體GluN1亞基功能改變和關(guān)鍵蛋白激酶在瑞芬太尼痛覺過敏機(jī)制的報(bào)道不多。 本研究旨在從整體、亞細(xì)胞、分子等不同水平以非切口疼痛細(xì)胞模型研究瑞芬太尼對NMDA受體電生理變化的影響；瑞芬太尼、氯胺酮、納洛酮對GluN1磷酸化激活的影響；蛋白激酶C（PKC）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKII）對GluN1磷酸化的影響三個方面闡述由瑞芬太尼誘發(fā)的GluN1亞基活性改變，探討GluN1磷酸化在OIH中的機(jī)制及作用，從而推斷在初級傳入感覺神經(jīng)元谷氨酸受體調(diào)節(jié)和其在OIH發(fā)生和維持階段的作用，以期為進(jìn)一步研究阿片受體、NMDA受體在OIH乃至神經(jīng)元退行性變以及急性疼痛慢性化演變的作用與機(jī)制，開發(fā)新的疼痛治療藥物奠定基礎(chǔ)。 蛋白磷酸化是離子型谷氨酸受體NMDA翻譯后修飾的重要機(jī)制，GluN1亞基C末端具備多個絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，通過對這些不同的位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)磷酸化和活性依賴的磷酸化引起細(xì)胞和突觸輸入可逆的變化。本研究擬以大鼠脊髓背角神經(jīng)元痛覺過敏模型為基礎(chǔ),探討影響GluN1磷酸化的各種因素，從而揭示μ受體—Ca2+—PKC和CaMKII—GluN1受體激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑機(jī)制，證明瑞芬太尼對脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體GluN1亞基功能和表達(dá)的影響以及PKC和CaMKII在急性O(shè)IH發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用。 第一部分急性瑞芬太尼暴露后脊髓NMDA受體電生理變化特點(diǎn) 目的：探討脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞在急性瑞芬太尼暴露后N-甲基-D-天冬氨酸(GluN）的電流活動的濃度和時間變化特點(diǎn)，明確最大電流對應(yīng)的藥物濃度。 方法：原代培養(yǎng)E18-19d的胚胎大鼠脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，對照組（C組）給予生理鹽水，R1組（4nM）, R2組（6nM), R3組（8nM）瑞芬太尼作用原代大鼠脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞60min后，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄瑞芬太尼作用前（T0)、20min（T1)、40min（T2）、60min（T3）、80min（T4）、100min（T5）的電流。 結(jié)果：與C組相比，R1組、R2組、R3組在各時間點(diǎn)最大電流振幅均顯著升高，并呈顯著的時間依賴性，4nM瑞芬太尼（R1組）與6nM（R2組）、8nM（R3組）最大電流振幅在T2、T3、T4顯著增加（P0.05）；呈現(xiàn)迅速而持久的變化趨勢。 結(jié)論：4nM瑞芬太尼對GluN的電流增幅相比6、8nM瑞芬太尼明顯。瑞芬太尼導(dǎo)致大鼠背角神經(jīng)元GluN的快速且持久的電活動增加可能是OIH的電生理基礎(chǔ)，其對應(yīng)的分子機(jī)制尚不明確，以4nM瑞芬太尼為研究對象進(jìn)行以下研究。 第二部分瑞芬太尼誘導(dǎo)的脊髓GluN1亞基磷酸化 目的：研究大鼠脊髓背角神經(jīng)元經(jīng)急性瑞芬太尼暴露后GluN1亞基發(fā)生磷酸化及其時間依賴性；氯胺酮、納洛酮對GluN1的磷酸化的影響。 方法：原代培養(yǎng)大鼠脊髓背角神經(jīng)元分為6組，A組：瑞芬太尼+甘氨酸組，B組：甘氨酸組；C組：瑞芬太尼+甘氨酸+氯胺酮組，D組：甘氨酸+氯胺酮組；E組：瑞芬太尼+甘氨酸+納洛酮組，F(xiàn)組：甘氨酸+納洛酮組。利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測洗脫后1h、2h、4h、24hGluN1的GluN1和磷酸化GluN1（p-GluN1）。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試驗(yàn)揭示瑞芬太尼、氯胺酮、納洛酮對GluN1mRNA的影響。 結(jié)果: Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GluN1A組四個時間點(diǎn)GluN1表達(dá)均明顯少于B組（P0.01），組內(nèi)p-GluN1在4h和24h相比1h和2h明顯增加（P0.05）；A和B兩組相比C、D組各自的GluN1數(shù)量減少更顯著；EF兩組在2、4、24hGluN1表達(dá)顯著性差異。A組p-GluN1濃度則從1h開始緩慢增加在24h達(dá)到峰濃度；E組內(nèi)p-GluN1在2h、4h、24h相比1h差異增加（P0.05）。各組PCR的GluN1mRNA表達(dá)也呈現(xiàn)明顯的時間依賴性，6組中加入瑞芬太尼后1、2、4、24hGluN1mRNA表達(dá)均明顯減少（P0.05），以4h和24h受抑制最明顯；C、D兩組則更明顯，隨時間延長對GluN1mRNA表達(dá)抑制一直持續(xù)至24h，且A、C兩組相比隨著氯胺酮的加入對GluN1mRNA表達(dá)抑制更加明顯（P0.05）；E、F兩組除在2h對GluN1mRNA表達(dá)沒有明顯影響外，其余時間點(diǎn)仍顯示對GluN1表達(dá)是抑制作用。 結(jié)論:4nM瑞芬太尼使大鼠脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞膜上GluN1表達(dá)減少，GluN1磷酸化增加和抑制GluN1mRNA表達(dá)是其內(nèi)向電流增加的分子基礎(chǔ)，呈現(xiàn)時間依賴特點(diǎn)。μ受體在GluN1亞基激活中發(fā)揮了重要作用，磷酸化GluN1表達(dá)增加是OIH的相關(guān)分子機(jī)制之一。 第三部分PKC及CaMKII對瑞芬太尼暴露后脊髓GluN1亞基磷酸化的影響 目的：研究急性瑞芬太尼暴露對大鼠脊髓背角神經(jīng)元PKC及CaMKII表達(dá)的影響以及PKC及CaMKII對脊髓NMDA受體GluN1亞基磷酸化的影響。 方法：原代培養(yǎng)大鼠脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)4nm濃度瑞芬太尼60min后洗脫，立即和間隔1h測定PKC和CaMKII表達(dá)，并分別加入50和100μmo/L的KN93和Chelerythrine作用30min后，利用Westernblotting分別測定瑞芬太尼作用60min和120min后的GluN1和磷酸化GluN1（p-GluN1）表達(dá)。 結(jié)果：4nm瑞芬太尼作用大鼠脊髓背角神經(jīng)元1h后PKC濃度明顯增加并持續(xù)至2h（P0.05），CaMKII濃度1h變化不明顯，2h開始增加。2hPKC濃度開始下降CaMKII濃度上升。GluN1變化時間表達(dá)逐漸減少，但無顯著性差異；p-GluN1則隨時間表達(dá)逐漸增強(qiáng)。A1組和A2組加入KN93后再測定p-GluN1， A1組顯著降低（0.42vs0.21；P0.05），A2組（0.49vs0.33；P0.05），KN93拮抗CaMKII后GluN1的磷酸化明顯受抑制。B1組和B2組加入chelerythrine作用1h后再測定p-GluN1，B1組顯著降低（0.42vs0.26；P0.05），B2組（0.49vs0.36；P0.05），加入chelerythrine后GluN1的磷酸化明顯受抑制。 結(jié)論：PKC和CaMKII參與了GluN1的磷酸化，由PKC介導(dǎo)GluN磷酸化是急性O(shè)IH起始的因素，而由CaMKII介導(dǎo)的磷酸化是OIH維持的主要原因；選擇性抑制PKC或CaMKII是治療OIH的靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻(xiàn)】

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1 李惠萍;吳鋼;韋成全;莫玉蘭;裴世成;戴體俊;;氯胺酮鎮(zhèn)痛作用與3種受體的關(guān)系[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2007年10期

2 信文君;許繼田;宮慶娟;魏緒紅;張彤;李永勇;劉先國;;CaMK Ⅱ在脊髓背角LTP中調(diào)節(jié)AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2007年03期

本文編號：2445499