【摘要】：【背景】 腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是終末期腎�。‥nd Stage Renal Disease，ESRD）患者腎臟替代治療的主要方法之一，這基于腹膜作為半透膜具有超濾和彌散的功能。腹膜長期暴露于生物不相容的腹膜透析液（peritoneal dialysis fluid, PDF）、反復(fù)發(fā)作的腹膜炎以及腹腔積血，，都會造成腹膜的炎癥和損傷。長期的腹膜炎癥促使腹膜間皮細(xì)胞表型改變、新血管生成增加、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和炎細(xì)胞浸潤，使腹膜處于高轉(zhuǎn)運狀態(tài)，最終導(dǎo)致腹膜纖維化。這些改變與小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運率以及腹膜功能超濾衰竭密切相關(guān)�；|(zhì)沉積和炎性細(xì)胞因子的分泌被認(rèn)為是引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的主要原因之一。腹膜間皮細(xì)胞對腹膜改變、尤其是炎癥導(dǎo)致的腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用。以白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎癥因子、細(xì)胞因子及某些生長因子表達(dá)增加為特征的復(fù)雜的炎癥反應(yīng)過程是導(dǎo)致腹膜透析患者腹膜纖維化，最終導(dǎo)致腹膜失功的中心環(huán)節(jié)。 轉(zhuǎn)錄因子剪接型X盒結(jié)合蛋白1（X-Box Binding Protein1spliced，XBP1s）是非折疊蛋白反應(yīng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Unfolded protein response，UPR/endoplasmic reticulumstress，ER stress）的重要通路蛋白之一，通過調(diào)控包括核因子κB（Nucleus Factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）、活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）等多條途徑?jīng)Q定著炎癥的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。已證明，XBP1s可以通過ER stress通路介導(dǎo)c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）相關(guān)的炎癥因子IL-6分泌。也可以直接促發(fā)Toll樣受體（Toll LikeReceptor，TLR）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α（TumorNecrosis Factor，TNF-α）的大量分泌。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中，XBP1s作為關(guān)鍵分子起重要調(diào)節(jié)作用。 本研究通過體外和體內(nèi)實驗初步驗證XBP1s在炎癥誘導(dǎo)的腹膜纖維化形成過程中的重要作用及部分機制，為炎癥導(dǎo)致腹膜纖維化尋找出了新的決定性分子，可能為未來通過干預(yù)炎癥來防治腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化尋找出藥物或基因治療的靶分子。 【目的】 1)探討XBP1s與腹膜間皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)系； 2)驗證XBP1s抑制劑對CG誘導(dǎo)的腹膜炎大鼠腹膜纖維化的作用。 【方法】 1）收集和培養(yǎng)接受連續(xù)不臥床腹膜透析（Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis，CAPD）治療的ESRD患者腹膜透析流出液細(xì)胞，Western blotting檢測細(xì)胞中XBP1s蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測腹膜透析流出液細(xì)胞中XBP1s和IL-1βmRNA表達(dá)； 2）不同濃度IL-1β刺激人腹膜間皮細(xì)胞（Human Peritoneal Mesothelial Cells，HPMC）24h，Real-time PCR檢測XBP1s、XBP1t mRNA表達(dá)； 3）以篩選出的IL-1β濃度刺激HPMC不同時間，Western blotting和Real-time PCR檢測XBP1s蛋白及mRNA表達(dá)，Real-time PCR檢測IL-1β mRNA表達(dá)，ELISA檢測IL-6表達(dá)，Western blotting檢測Fibronectin的表達(dá)變化； 4）XBP1s抑制劑（STF083010）處理IL-1β誘導(dǎo)的HPMC，Western blotting方法檢測XBP1s的表達(dá)，Real-time PCR檢測IL-1β mRNA的表達(dá)，ELISA檢測IL-6的表達(dá)，Western blotting檢測Fibronectin的表達(dá)變化； 5）XBP1s抑制劑與IL-1β聯(lián)合刺激HPMC后，Western blotting檢測JNK和P-JNK表達(dá)； 6）建立急性腹膜炎誘發(fā)大鼠腹膜纖維化的模型，模型組腹腔注射0.05%葡萄糖酸氯己定（Chlorhexidine Gluconate，CG），抑制劑組腹腔注射CG和XBP1s抑制劑，對照組注射含10%乙醇的生理鹽水，2周后麻醉處死； 7）H-E和masson染色觀察各組大鼠壁層腹膜組織結(jié)構(gòu)；Western blotting檢測XBP1s的表達(dá)變化；免疫組化法檢測XBP1、F4/80、α-SMA和CD31的表達(dá)變化。 【結(jié)果】 1)不同透齡的ESRD患者腹膜透析流出液細(xì)胞XBP1s蛋白表達(dá)存在差異；XBP1smRNA的相對表達(dá)量和腹膜透析時間呈正相關(guān)，與IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)。 2)不同濃度IL-1β處理HPMC24小時，XBP1s和XBP1t mRNA表達(dá)增加，二者比值增加，2ng/ml濃度時增高最明顯；2ng/ml濃度IL-1β處理HPMC不同時間，XBP1s蛋白和mRNA表達(dá)增加，提示XBP1s在IL-1β誘導(dǎo)HPMC的表達(dá)變化存在劑量和時間依賴性； 3) IL-1β處理HPMC不同時間，IL-1β mRNA和IL-6蛋白表達(dá)增加，F(xiàn)ibronectin表達(dá)增加； 4) XBP1s抑制劑降低IL-1β誘導(dǎo)的HPMC中IL-1β mRNA和IL-6蛋白表達(dá)，下調(diào)Fibronectin的表達(dá)； 5) XBP1s抑制劑顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的HPMC中JNK的磷酸化活化，而對總JNK表達(dá)無明顯影響。 6)與對照組相比，H-E和masson染色發(fā)現(xiàn)模型組腹膜明顯增厚和基質(zhì)積聚，而XBP1s抑制劑部分抑制了大鼠模型的腹膜纖維化程度； 7)與對照組相比，模型組腹膜組織XBP1s蛋白表達(dá)增加；與模型組比較，抑制劑組XBP1s蛋白表達(dá)下降；免疫組化結(jié)果顯示，模型組XBP1、F4/80、α-SMA及CD31增加。與模型組比較，XBP1、F4/80、α-SMA及CD31陽性表達(dá)減少。 【結(jié)論】 1）XBP1s介導(dǎo)了IL-1β誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)； 2）XBP1s抑制劑對炎癥誘導(dǎo)的腹膜纖維化形成起部分緩解作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692.5

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本文編號：2418186