【摘要】：研究目的 椎間盤細(xì)胞生活在一個(gè)低氧的微環(huán)境中，低氧張力是調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的重要因素。Notch信號(hào)通路是一個(gè)對(duì)低氧敏感、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的重要信號(hào)通路，為闡明椎間盤中低氧環(huán)境和Notch信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成的可能機(jī)制，我們擬通過實(shí)驗(yàn)明確以下幾個(gè)問題：①不同氧濃度培養(yǎng)對(duì)大鼠髓核細(xì)胞細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、表型表達(dá)等的影響，Notch信號(hào)抑制劑對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響；②不同濃度低氧模擬類似物去鐵胺干預(yù)髓核細(xì)胞對(duì)髓核細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、表型表達(dá)等的影響；③比較不同氧濃度和去鐵胺干預(yù)條件下大鼠髓核細(xì)胞Notch通路相關(guān)靶基因和HIF-α的表達(dá)情況，初步闡明氧濃度和去鐵胺促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。 研究內(nèi)容 ①取4只3周齡SD大鼠（體重200至220克左右），2.5%戊巴比妥麻醉，脊柱區(qū)皮膚備皮，無菌條件下取出腰段脊柱，分離獲得Uk喱狀髓核組織，，0.2%II型膠原酶消化，將獲得的髓核細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中采用第三代髓核細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)染色，免疫細(xì)胞化學(xué)和半定量PCR方法鑒定髓核細(xì)胞表型。將髓核細(xì)胞分別置于常氧（21%O2）和低氧（1%O2）條件下培養(yǎng)8至24小時(shí)，通過CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化情況；運(yùn)用Notch信號(hào)通路抑制劑干預(yù)髓核細(xì)胞，CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，通過Real-time PCR檢測不同氧濃度干預(yù)下髓核細(xì)胞表型表達(dá)變化。 ②運(yùn)用不同濃度去鐵胺（25umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L）干預(yù)髓核細(xì)胞，通過CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，通過Real-time PCR檢測適當(dāng)濃度去鐵胺對(duì)髓核細(xì)胞表型表達(dá)的影響。 ③將髓核細(xì)胞分別置于常氧、低氧及去鐵胺干預(yù)條件下培養(yǎng)8至48小時(shí)，通過Real-time PCR、Western-blot檢測不同培養(yǎng)條件下Notch信號(hào)通路相關(guān)分子及HIF-α的表達(dá)情況，初步探討氧濃度及去鐵胺影響髓核細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。 結(jié)果 ①CCK-8結(jié)果顯示：與常氧培養(yǎng)相比，髓核細(xì)胞在低氧培養(yǎng)時(shí)所測OD值明顯升高；無論在常氧或低氧培養(yǎng)條件下，加入Notch抑制劑干預(yù)后所測OD值明顯降低；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：與常氧培養(yǎng)相比，髓核細(xì)胞在低氧培養(yǎng)時(shí)處于S期細(xì)胞所占百分率明顯升高，加入Notch抑制劑干預(yù)后處于S期細(xì)胞所占百分率明顯降低；低氧干預(yù)后，髓核細(xì)胞COL2A1、Aggrecan、Sox-9、COL1A1mRNA表達(dá)水平都有不同程度升高。 ②CCK-8結(jié)果顯示：25umol/L、50umol/L去鐵胺干預(yù)髓核細(xì)胞時(shí)，OD值明顯升高，200umol/L去鐵胺干預(yù)時(shí)，OD值明顯下降，而100umol/L去鐵胺干預(yù)時(shí)，OD值與對(duì)照組相比無明顯差異；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：50umol/L去鐵胺干預(yù)時(shí)，處于S期細(xì)胞所占百分比都有增加，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50umol/L DFO干預(yù)髓核細(xì)胞后COL2A1、Aggrecan mRNA表達(dá)升高，Sox-9mRNA表達(dá)水平下降，COL1A1mRNA無明顯變化。 ③髓核細(xì)胞在低氧培養(yǎng)8~24小時(shí)后，Notch靶基因Hes1、Hes5、Hes7mRNA都有不同程度上調(diào)，Hey1、Hey2mRNA表達(dá)水平下調(diào)；Hes1、Hes7蛋白在低氧干預(yù)24~48小時(shí)后表達(dá)上升，而Hes5表達(dá)水平無明顯變化；低氧干預(yù)24~48小時(shí)后HIF-1αmRNA和蛋白質(zhì)水平都有明顯上調(diào)，HIF-2α表達(dá)無明顯變化。50umol/L去鐵胺干預(yù)后,髓核細(xì)胞Notch信號(hào)通路靶基因Hes1、Hes7、Hey1mRNA表達(dá)都有不同程度下降，Hes7蛋白表達(dá)水平下降，Hes5表達(dá)水平無明顯變化；去鐵胺干預(yù)后HIF-1α和HIF-2α表達(dá)水平都有不同程度升高。 結(jié)論 ①體外低氧微環(huán)境可以促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成； ②體外低氧微環(huán)境可以通過上調(diào)Notch信號(hào)靶基因的表達(dá)水平來促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖，Notch信號(hào)相關(guān)靶基因可以作為研究靶點(diǎn)，用于體外調(diào)控髓核細(xì)胞增殖分化的過程； ③體外適當(dāng)濃度去鐵胺可以促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，去鐵胺可能通過上調(diào)HIF-1α/HIF-2α的方式參與調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞增殖的過程，去鐵胺可能作為一種治療藥物用于延緩椎間盤退變的過程。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R681.53

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉勇,胡有谷,呂振華;腰椎間盤細(xì)胞的培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1999年02期

本文編號(hào)：2416070