【摘要】：研究背景和目的發(fā)育期神經(jīng)元處于興奮與抑制的不平衡狀態(tài)。在發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng),GABA作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在發(fā)育期神經(jīng)元生長及突觸形成中發(fā)揮著重要的作用。在這種缺乏抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的狀態(tài)下,并沒有導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)元產(chǎn)生病理性改變,相反可以促進(jìn)發(fā)育期神經(jīng)元生長及可塑性,究其原因可能與NMDA受體的發(fā)育期特點有關(guān)。在海馬所在的前腦區(qū),NMDA受體NR2A/NR2B比例會隨個體發(fā)育而升高,而LTP和LTD誘導(dǎo)的難易程度也隨之發(fā)生變化,提示了NR2A/NR2B比例可能影響腦的發(fā)育和突觸可塑性的形成。NMDA受體亞單位隨著神經(jīng)元發(fā)育及活動依賴性轉(zhuǎn)變。研究表明NMDA受體亞單位從發(fā)育期NR2B到成熟期NR2A轉(zhuǎn)變受到PKA、PKC、及CK2等激酶的調(diào)節(jié)。NR2B受體是防止發(fā)育期神經(jīng)元過度興奮性損傷的天然屏障。在發(fā)育期神經(jīng)元,突觸后膜主要表達(dá)NR2B受體。出生后,隨著神經(jīng)元的發(fā)育生長,NR2B受體逐漸被NR2A受體取代。通過磷酸化NR2B受體,導(dǎo)致NR2B受體胞吞和NR2A受體插入突觸后膜,突觸發(fā)育成熟。Cdk5的調(diào)節(jié)激動劑p35,是一種大腦特異性的鈣蛋白酶作用底物,Cdk5和p35都是維持大腦發(fā)育和存活的重要通道蛋白。谷氨酸鹽激活原代神經(jīng)元中的NMDAR,可以激發(fā)鈣依賴性-鈣蛋白酶介導(dǎo)的p35蛋白水解為更小分子量的p25,部分程度上因為Cdk5的異常激活和靶向重置而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。因此,在這些神經(jīng)元中,抑制鈣蛋白酶或Cdk5可以阻止p25介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。需要指出的是,經(jīng)歷某些形式的非興奮毒性損傷的神經(jīng)元同樣需要鈣蛋白酶介導(dǎo)產(chǎn)生的p25,提示鈣蛋白酶抑制劑的治療潛力不僅局限于神經(jīng)元興奮毒性損傷。與其在興奮毒性中的重要角色相一致的是,在局部缺血性腦卒中和全大腦缺血的小鼠模型的大腦中,以及阿爾茨海默病患者和缺血性中風(fēng)患者腦組織樣本中,p25表達(dá)是增加的。重要的是,轉(zhuǎn)基因小鼠前腦中p25的過表達(dá)會觸發(fā)神經(jīng)退行性變,抑制Cdk5或它的下游目標(biāo)基因,可以阻止由p25和腦缺血引起的神經(jīng)元損傷。盡管有很多蛋白是Cdk5的磷酸化底物,p25誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷被證明是由Cdk5介導(dǎo)的NMDAR的GluN2A亞單位磷酸化、肌細(xì)胞增強因子2和抗氧化劑酶Prx2和無嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶的磷酸化和抑制以及組蛋白脫乙酰酶的抑制所引起。本實驗室最近研究證實吸入麻醉藥劑量依賴性易化發(fā)育期神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道(Voltage dependent calcium channels,VDCC)和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受體,增加神經(jīng)元內(nèi)自由鈣離子濃度,導(dǎo)致明顯的毒性反應(yīng)。對吸入性全身麻醉藥致發(fā)育神經(jīng)元突觸可塑性及其機(jī)制進(jìn)行深入研究,并探索有效的防治手段,對指導(dǎo)臨床安全使用吸入性全身麻醉藥顯得尤其重要。本實驗擬證實以下幾個假設(shè)：1.異氟烷通過改變NMDAR磷酸化程度和其亞型比例,影響發(fā)育期神經(jīng)元形態(tài)和功能。2.異氟烷通過CK2-CDK5-p35通路影響NMDAR受體構(gòu)成及功能。3.臨床相關(guān)濃度異氟烷對發(fā)育期大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能并無顯著影響。研究方法和結(jié)果1.測定吸入異氟烷前后海馬神經(jīng)元NMDA受體亞單位表達(dá)的變化選擇同窩出生5天SD大鼠,隨機(jī)分組,處理組在相同條件下分別吸入相同濃度異氟烷(MAC 1.3)2、4、6小時,對照組吸入空氣,24小時之后處死大鼠并分離海馬組織。利用Western Blot方法,檢測吸入麻醉藥干預(yù)前后海馬神經(jīng)元NR2A和NR2B蛋白表達(dá)變化及S1480位點磷酸化程度的改變。結(jié)果：臨床相關(guān)濃度異氟烷(Mac 1.3)呈劑量依賴性降低NR2B的Ser1480位點磷酸化,減少細(xì)胞膜上的NR2B表達(dá)(P0.05),而NR2B總表達(dá)量和NR2A表達(dá)無顯著變化。異氟烷吸入4小時組海馬神經(jīng)元的NR2B-PSD95復(fù)合物比對照組顯著減少(P0.05)。這也證明了NR2B的Ser1480位點磷酸化能破壞NR2B與PSD95的結(jié)合,并減少細(xì)胞膜表面的NR2B表達(dá),導(dǎo)致NR2B向胞內(nèi)運輸。2.異氟烷對發(fā)育期海馬神經(jīng)元CK2信號通路的影響選擇同窩出生5天SD大鼠,隨機(jī)分組,處理組在相同條件下分別吸入相同濃度異氟烷(MAC 1.3)2、4、6小時,對照組吸入空氣,24小時之后處死大鼠并分離海馬組織。采用Western Blot方法,檢測海馬神經(jīng)元CK2、p35、p25的蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果：臨床相關(guān)濃度異氟烷呈劑量依賴性降低CK2表達(dá),增加p35、p25蛋白水平表達(dá)(P0.05)。3.異氟烷對發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響選擇同窩出生5天SD大鼠,隨機(jī)分為對照組、異氟烷吸入組、異氟烷+Minocycline組,異氟烷+Minocycline組大鼠麻醉前12小時預(yù)先給予Minocycline腹腔注射45mg/kg處理,后兩組在相同條件下分別吸入相同濃度異氟烷(MAC 1.3)4小時,對照組吸入空氣,24小時之后處死大鼠,取出完整大腦組織制作海馬區(qū)冰凍切片。免疫熒光法檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3活性細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果：異氟烷吸入組的Caspase-3活化細(xì)胞數(shù)量顯著大于對照組(P0.05),而加入抑制劑Minocycline的組Caspase-3活化細(xì)胞數(shù)量和對照組無明顯差異。4.CDK5抑制劑Roscovitine對異氟烷吸入處理后大鼠海馬神經(jīng)元NMDAR表達(dá)的影響選擇同窩的出生5天SD大鼠,隨機(jī)分成對照組,Roscovitine組,異氟烷處理組,異氟烷+Roscovitine組。其中Roscovitine組和異氟烷+Roscovitine組的大鼠預(yù)先給予Roscovitine。在35℃溫箱中,異氟烷處理組和異氟烷+Roscovitine組分別吸入相同濃度異氟烷(Mac 1.3)達(dá)4小時,氧流量1L/min;對照組和Roscovitine組吸入空氣,24小時之后處死大鼠,分離海馬組織并提取蛋白。采用Western Blot法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元NR2B、p-NR2B (S1480)蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果：與對照組相比,異氟烷處理組中,細(xì)胞膜上NR2B、p-NR2B (Ser1480)表達(dá)減少而向胞漿中轉(zhuǎn)運：而異氟烷+Roscovitine組相比異氟烷組,膜上的NR2B蛋白及磷酸化表達(dá)明顯增多(P0.05)。對照組和Roscovitine組中這兩種蛋白表達(dá)無明顯差異。5.CDK5抑制劑Roscovitine對異氟烷吸入后海馬神經(jīng)元CDK5-p35-CK2信號通路的影響選擇同窩的出生5天SD大鼠,隨機(jī)分成對照組,Roscovitine組,異氟烷處理組,異氟烷+Roscovitine組。異氟烷處理組和異氟烷+Roscovitine組分別吸入相同濃度異氟烷(Mac 1.3)達(dá)4小時,氧流量1L/min;對照組和Roscovitine組吸入空氣,24小時之后處死大鼠,分離海馬組織并提取蛋白。采用Western Blot法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元CK2、p35/p25蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果：異氟烷組中CK2較之對照組和Roscovitine組表達(dá)明顯減少,p35/p25表達(dá)增加(P0.05)；異氟烷+Roscovitine組CK2的表達(dá)比異氟烷組明顯增多,與對照組無顯著差異。6.CDK5抑制劑Roscovitine處理異氟烷吸入的大鼠海馬各區(qū)域p-NR2B (S1480)表達(dá)變化選擇同窩的出生5天SD大鼠,隨機(jī)分成對照組,Roscovitine組,異氟烷處理組,異氟烷+Roscovitine組。異氟烷處理組和異氟烷+Roscovitine組分別吸入相同濃度異氟烷(Mac 1.3)達(dá)4小時,氧流量1L/min;對照組和Roscovitine組吸入空氣,24小時之后處死大鼠,分離新鮮腦組織并制作海馬區(qū)的冰凍切片。運用免疫組化法觀察大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元p-NR2B(S1480)表達(dá)數(shù)量的變化。結(jié)果：免疫組化切片顯示,與對照組、Roscovitine組相比,異氟烷組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元NR2B的Ser1480位點磷酸化的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05), CA1、DG區(qū)無明顯差異;異氟烷+Roscovitine組各區(qū)海馬神經(jīng)元磷酸化數(shù)量與對照組相比無明顯差異。7.遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試選擇同窩出生5天SD大鼠,隨機(jī)分成處理組和對照組,處理組在血氧飽和度監(jiān)測下分別吸入相同濃度異氟烷(MAC 1.3)2小時、4小時、6小時,對照組吸入空氣,然后在相同生存環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)至成年(8周),采用Barnes Maze行為學(xué)測試方法檢測其空間學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果：測試第5天和第12天,6h組大鼠比對照組、2h組、4h組大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞的潛伏期均明顯增長(P0.05),錯誤次數(shù)無明顯差異。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組內(nèi)比較采用one-way ANOVA方差分析,組間比較采用配對t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)論和總結(jié)一、主要研究結(jié)果1.5天齡大鼠吸入不同時間的臨床相關(guān)濃度異氟烷,證實了其劑量依賴性通過改變NMDAR磷酸化程度和其亞型比例,影響發(fā)育期神經(jīng)元形態(tài)和功能。2.通過在體大鼠吸入異氟烷,證實其通過CK2-CDK5-p35通路影響NMDAR受體構(gòu)成及功能。3.成年后大鼠行為學(xué)實驗提示小劑量的臨床相關(guān)濃度異氟烷對發(fā)育期大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能并無顯著影響。二、研究結(jié)論1.吸入麻醉藥異氟烷通過下調(diào)CK2,過度激活CDK5-p35而磷酸化大鼠發(fā)育期神經(jīng)元中NR2B的Tyr1472位點,引起NR2B向胞內(nèi)運輸；下調(diào)NR2B的Ser1480位點磷酸化,破壞NR2B與PSD95的結(jié)合,并減少細(xì)胞膜表面的NR2B表達(dá)。以上兩方面同時導(dǎo)致NR2B提前轉(zhuǎn)變?yōu)镹R2A,致發(fā)育期神經(jīng)元生長、突觸形成及可塑性的改變,而這一過程可通過抑制CDK5而達(dá)到降低異氟烷神經(jīng)元興奮性毒性的作用。2.成年后SD大鼠Barnes Maze行為學(xué)測定空間學(xué)習(xí)記憶功能方面的實驗結(jié)果,表明吸入臨床相關(guān)濃度異氟烷適當(dāng)時間內(nèi)對發(fā)育期神經(jīng)元遠(yuǎn)期神經(jīng)毒性尚不明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614
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本文編號：
2411888
