【摘要】：研究背景：體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass, CPB)技術(shù)自二十世紀五十年代成功用于臨床以來,已成為心內(nèi)直視手術(shù)的必備手段,隨著科學(xué)技術(shù)的進步,體外循環(huán)機器和相關(guān)管道材料的改良,術(shù)中心肌保護、灌注技術(shù)以及圍手術(shù)期監(jiān)護治療水平的進步,CPB手術(shù)的安全性大大提高,但是CPB帶來的非生理性的血流灌注仍可誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),導(dǎo)致術(shù)后各臟器系統(tǒng)不同程度的損傷。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是SIRS的早中期改變,癥狀輕的患者僅為亞臨床表現(xiàn),而重癥患者則表現(xiàn)為ALI,甚至是急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。ALI/ARDS會顯著延長病人術(shù)后呼吸機應(yīng)用時間、ICU滯留時間等,不但增加了家庭及社會負擔,而且增加患者的死亡率,嚴重影響預(yù)后。因此,研究CPB對肺的損傷機制以及探索行之有效的肺保護方法,對CPB手術(shù)患者術(shù)后肺功能的恢復(fù)及遠期生存至關(guān)重要。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)是一種具有蛋白酶抑制作用的急性時相反應(yīng)蛋白,分子量為5.2kDa,是血漿中主要的蛋白酶抑制物,能抑制中性粒細胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、血漿素等蛋白酶的活性,可以保護機體內(nèi)的正常組織避免蛋白酶的損傷。最近的研究表明αl-AT可抑制炎癥反應(yīng)過程中的多個環(huán)節(jié),抑制炎癥介質(zhì)和細胞因子的過度釋放,減少PMN的激活,清除超氧陰離子、自由基等活性氧,維持氧化/抗氧化物的動態(tài)平衡,避免過度應(yīng)激對機體自身的損傷,繼而具有防治肺損傷的功效。本研究從炎癥因子的釋放、細胞凋亡、氧化-抗氧化角度探討α1-AT對CPB術(shù)后肺功能的保護作用。第一部分血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與急性肺損傷的相關(guān)性研究目的：急性肺損傷(ALI)是體外循環(huán)(CPB)心臟手術(shù)后常見的并發(fā)癥。本研究擬觀察CPB心臟直視手術(shù)圍術(shù)期內(nèi)血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)的水平變化,明確氧化應(yīng)激與CPB術(shù)后ALI的相關(guān)性,以及AOPPs預(yù)測CPB術(shù)后ALI的有效性。內(nèi)容與方法：本研究為前瞻性研究,經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會同意批準,將2014年1月1日至5月31日南方醫(yī)院胸心外科在CPB下行心臟手術(shù)的患者納入本研究。參考1994年歐美聯(lián)系會議制定的ALI診斷標準,根據(jù)患者CPB手術(shù)后是否發(fā)生ALI,將患者分為ALI組和非ALI組。在術(shù)前、術(shù)后1小時、術(shù)后12小時、術(shù)后24小時和術(shù)后48小時獲得患者全血2m1。采用ELISA方法檢測血漿中AOPPs的濃度。研究所涉及的計量數(shù)據(jù),均先通過one-sample Kolmogorov-smimov檢驗進行正態(tài)分布檢驗。Student's t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗檢測兩組之間各指標的差異。應(yīng)用多因素逐步Logistic (stepwise logistic)回歸模型分析AOPPs與ALI發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性,以受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積(AUC)評價這個生物學(xué)指標的回歸模型對ALI的診斷價值。所有統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進行分析,P0.05為有顯著性差異。結(jié)果:在本研究期間共有70例符合本研究納入標準的、在CPB下行心臟手術(shù)的成人患者,其中18人(25.7%)發(fā)生ALI。ALI組患者慢性阻塞性肺病、高血壓的患病率高于非ALI組。ALI組患者住院時間和重癥監(jiān)護時間較非ALI組患者明顯延長。CPB結(jié)束后,所有患者血漿中AOPPs的濃度較術(shù)前明顯升高,并且在術(shù)后1小時開始升高,術(shù)后12小時開始下降。ALI組患者CPB術(shù)后1小時、12小時、24小時、48小時AOPPs濃度明顯高于非ALI組患者。非ALI組患者血漿AOPPs濃度在術(shù)后24小時降至基線水平,ALI組患者血漿AOPPs濃度在術(shù)后1小時達到峰值,術(shù)后12小時快速下降,在術(shù)后24小時再次升高。通過多因素回歸分析顯示,CPB術(shù)后1小時血漿中AOPPs濃度(OR=1.164,95% CI 1.068-1.269, P=0.001)、術(shù)前合并慢性阻塞性肺病(OR=28.706,95% CI 1.770-465.640, P=0.018)是術(shù)后ALI發(fā)生的獨立危險因素。通過ROC曲線分析CPB術(shù)后1小時血漿AOPPs濃度對術(shù)后ALI的診斷價值,結(jié)果顯示曲線下面積為0.875(95%置信區(qū)間,0.774-0.942),診斷截斷值為81.89μmol/L。結(jié)論：本研究表明,CPB術(shù)后血漿中AOPPs的濃度明顯升高,其升高水平與肺損傷程度明顯相關(guān)。血漿中AOPPs是CPB術(shù)ALI早期可靠的預(yù)測指標。AOPPs在CPB術(shù)后肺損傷的臨床表現(xiàn)和病情進展中的作用還需要進一步的研究。第二部分α1-抗胰蛋白酶對體外循環(huán)肺損傷保護作用的實驗研究目的：1、應(yīng)用α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)對體外循環(huán)(CPB)術(shù)后急性肺損傷(ALI)比格犬進行干預(yù),從氧化-抗氧化角度說明其對肺臟具有保護作用。2、研究α1-AT對比格犬CPB術(shù)后肺部炎癥反應(yīng)的抑制作用,并探討其抑制炎癥的作用機制。內(nèi)容與方法：1、急性肺損傷模型的建立。選取成年健康比格犬30只(14.5±0.63)kg,隨機分為3組,Ⅰ組(空白對照組),Ⅱ組(CBP術(shù)后AL1組),Ⅲ組(CPB術(shù)后ALI+α1-AT干預(yù)組)。采用2%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(劑量30mg/kg),CPB手術(shù)過程中用微量泵持續(xù)泵入維持麻醉效果(劑量10 mg/kg/h)。比格犬取仰臥位,固定后經(jīng)口氣管插管(根據(jù)體重選取合適管徑),連接呼吸機輔助通氣,設(shè)置呼吸頻率18次/min,潮氣量15 ml/kg,右側(cè)頸內(nèi)靜脈及右側(cè)股動脈穿刺置管,用導(dǎo)管鞘的側(cè)管連接PiCCO的溫度探頭,右股動脈導(dǎo)管用于連接PICCO的監(jiān)護儀。Ⅰ組僅行正中開胸手術(shù),不行CPB。Ⅱ、Ⅲ組建立CPB,在CPB期間阻閉左肺動脈并行右側(cè)肺單肺通氣,同時連續(xù)監(jiān)測動脈血氣分析。2、給藥方法及監(jiān)測指標。Ⅲ組在預(yù)充液中加入50 mg/kg劑量的α1-AT。分別記錄各組動物T1：CPB手術(shù)前,T2:CPB轉(zhuǎn)機后30分鐘,T3：CPB轉(zhuǎn)機后2小時,T4：CPB結(jié)束后6小時,T5:CPB結(jié)束后12小時的心率、血壓、氧飽和度等生命體征,在每個時間點留動脈血標本,用于實時監(jiān)測血氣分析及其他炎癥指標的檢測。根據(jù)PaO2、FiO2計算氧合指數(shù)；通過脈搏指示連續(xù)心排血量監(jiān)測技術(shù)(PiCCO監(jiān)測技術(shù))連續(xù)監(jiān)測血管外肺水指數(shù)(EVLWI)、肺毛細血管通透性指數(shù)(PVPI)。術(shù)后12小時處死比格犬,收集肺組織標本及支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本。檢測各時間點血清TNF-α、IL-8、MMP-9、AOPPs濃度,BALF標本測定蛋白含量,肺組織標本測定髓過氧化物酶(MPO)丙二醛(MDA)活力,以及肺濕/干重比值及肺含水量,并行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：1、血氣分析與血流動力學(xué)監(jiān)測結(jié)果：CPB術(shù)后急性肺損傷組(對照組)氧合指數(shù)較空白對照組顯著降低(P0.001),應(yīng)用α1-AT干預(yù)(實驗組)可以明顯提高比格犬氧合指數(shù),改善組織氧合。PiCCO監(jiān)測結(jié)果也顯示應(yīng)用α1-AT干預(yù)可以明顯降低EVLW、PVPI等血流動力學(xué)指標。2、與空白對照組比較,對照組、實驗組比格犬CPB術(shù)后血漿IL-8, TNF-a,MMP-9濃度均明顯升高(P0.001,P0.001,P0.001)。與對照組比較,使用α1-AT預(yù)處理能顯著降低這些炎癥因子與蛋白酶的水平。3、急性肺損傷過程中氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致了肺損傷,急性肺損傷組、α1-AT干預(yù)組血漿AOPPs濃度、肺組織MPO、MDA活性均較空白對照組顯著升高(P0.001,P0.001,P0.001)。應(yīng)用α1-AT干預(yù)能明顯降低肺組織內(nèi)的MPO、MDA的活性(P0.001,P0.001),以及血漿AOPPs的濃度(P0.001),明顯減輕了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺組織損傷。4、病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)α1-AT干預(yù)組比格犬的肺間質(zhì)水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡透明膜形成、肺組織出血、壞死等變化均較急性肺損傷組(對照組)明顯減輕。結(jié)論：1、α1-AT可有效減輕比格犬CPB術(shù)后肺損傷,改善肺功能和組織氧合、降低血管外肺水指數(shù)及毛細血管通透性指數(shù),減輕肺水腫。2、α1-AT能顯著減少比格犬CPB術(shù)后肺組織中炎癥因子及蛋白酶的表達,減輕炎癥反應(yīng)。3、α1-AT通過減少活性氧生成,抑制氧化應(yīng)激對肺部的損害來實現(xiàn)其保護肺功能的作用。第三部分 α1-抗c蛋白酶對人肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用目的：本研究以體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞(HPAEpiC細胞)為研究對象,用H2O2處理HPAEpiC細胞,建立細胞氧化應(yīng)激損傷模型,觀察氧化應(yīng)激下,HPAEpiC細胞的活性氧(ROS)生成、細胞存活率,FasL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、 caspase-9、以及UCP-2的表達變化,以及預(yù)先給予α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)能否減少ROS生成、下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白、提高細胞存活率。初步探討α1-AT對肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。內(nèi)容與方法：實驗分為空白對照組、對照組(H2O2處理組)和實驗組(H2O2處理與α1-AT (2mg/ml)干預(yù)組),以濃度為500μmol/L的H2O2處理HPAEpiC細胞24 h。采用激光共聚焦顯微鏡檢測HPAEpiC細胞線粒體ROS產(chǎn)生,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,采用AnnexinV/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)測定FasL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、 caspase-9、以及UCP-2的表達變化。結(jié)果：1、與空白對照組比較,對照組的HPAEpiC細胞在H2O2的作用下凋亡率明顯升高(P0.05),同時FasL、Fas、以及cleaved caspase-8表達顯著上調(diào)。實驗組加入α1-AT后,HPAEpiC細胞凋亡率明顯下降(P0.05), FasL、Fas以及cleaved caspase-8表達也相應(yīng)下調(diào)。2、與空白對照組比較,對照組的HPAEpiC細胞caspase-3、caspase-9表達顯著上調(diào),而UCP-2表達下降(P0.05)。實驗組加入α1-AT后,HPAEpiC細胞caspase-3、caspase-9表達也相應(yīng)下調(diào),而UCP-2表達上調(diào)(P0.05)。結(jié)論：1、氧化應(yīng)激可以激活外源性凋亡通路,上調(diào)Fas、FasL、cleaved caspase-8表達,導(dǎo)致HPAEpiC細胞凋亡。2、氧化應(yīng)激可以激活內(nèi)源性凋亡通路,上調(diào)caspase-3、caspase-9表達,導(dǎo)致HPAEpiC細胞凋亡。3、α1-AT可以通過下調(diào)Fas、FasL、caspase-8表達抑制外源性通路介導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡；通過下調(diào)caspase-3、caspase-9表達抑制線粒體通路介導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡。4、α1-AT通過上調(diào)UCP-2減少HPAEpiC細胞內(nèi)ROS的生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R654.1;R563

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本文編號：2395626