【摘要】：一、背景 周圍神經(jīng)損傷的治療一直是顯微外科的難題,其中一些粗大、長段的周圍神經(jīng)缺損和多發(fā)性神經(jīng)損傷,其再生很難重建其正常結(jié)構(gòu),也很難再建立和遠(yuǎn)端的正常聯(lián)接。自體神經(jīng)移植在臨床上依舊是“金標(biāo)準(zhǔn)”,但有神經(jīng)來源有限、犧牲次要神經(jīng)功能、產(chǎn)生供區(qū)神經(jīng)瘤等缺點,且供體神經(jīng)常常無法滿足修復(fù)粗大神經(jīng)缺損的需要。因而臨床上迫切需要更安全有效的治療策略。人工合成可降解材料如聚乙醇酸導(dǎo)管NeurotubeTM聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物導(dǎo)管Neurolac、I型膠原導(dǎo)管NeuraGen等已被廣泛用于實驗及臨床修復(fù)感覺或運動神經(jīng)缺損,然而,由于缺乏良好微環(huán)境及充足的生物活性物質(zhì),單一的神經(jīng)導(dǎo)管很難修復(fù)長節(jié)段、粗大周圍神經(jīng)缺損。理想的神經(jīng)修復(fù)材料應(yīng)具有良好的細(xì)胞親和性和組織相容性,可在體內(nèi)降解吸收且降解產(chǎn)物無毒副作用,降解速度與神經(jīng)軸突再生相同步,并可為軸突生長提供所需的生物活性物質(zhì)。大量研究表明,細(xì)胞粘附因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子在損傷神經(jīng)再生和功能恢復(fù)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過引入外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和種子細(xì)胞,構(gòu)建出復(fù)合型神經(jīng)導(dǎo)管以促進受損神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù),成為目前神經(jīng)組織工程領(lǐng)域的研究熱點。 二、目的 1)體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,利用神經(jīng)營養(yǎng)因子對其進行定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞(BMSC-NCs),并以其為種子細(xì)胞,與自行研制的RGD多肽接枝聚(乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸)/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長因子(PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF, PNGF)支架材料復(fù)合構(gòu)建周圍神經(jīng)組織工程模型,通過動物實驗評估其用于修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的療效。 2)通過臨床應(yīng)用課題組研制的RGD多肽接枝聚(乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸)/聚乳酸/β-磷酸三鈣(PRGD/PDLLA/β-TCP, PRGD)復(fù)合型神經(jīng)導(dǎo)管,驗證該材料治療周圍神經(jīng)損傷的療效和安全性,并與同類產(chǎn)品臨床性能相比較,探索周圍神經(jīng)損傷后應(yīng)用該材料在促進神經(jīng)再生方面所起的作用及其安全性和適應(yīng)癥。 三、方法 1、利用差速貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并用表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合誘導(dǎo)其定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,免疫組化鑒定神經(jīng)元特異標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲蛋白和突觸囊泡膜特異性蛋白質(zhì)突觸素蛋白的表達。 2、SPF級雄性Wistar大鼠40只,隨機分為4組,每組10只,左側(cè)后肢建立12mm坐骨神經(jīng)缺損模型。三組為PNGF導(dǎo)管移植復(fù)合PBS (A), BMSCs(B), BMSC-NCs(C)；第四組為自體神經(jīng)移植組(D)。所有大鼠左側(cè)為實驗側(cè),右側(cè)為正常自身對照側(cè)。術(shù)后分籠喂養(yǎng),觀察切口愈合情況及步態(tài)。 3、術(shù)后3個月,將體內(nèi)神經(jīng)導(dǎo)管材料取出,觀察其大體形態(tài)、表面血管化及組織生長情況；制作大鼠足印行走箱,測定坐骨神經(jīng)功能指數(shù)；麻醉下對雙側(cè)肢體行神經(jīng)電生理檢查,記錄潛伏期、波幅并計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度；處死動物,取雙側(cè)小腿三頭肌,分析天平稱重后計算患側(cè)小腿三頭肌濕重恢復(fù)率；小腿三頭肌石蠟包埋后行HE染色進行組織學(xué)觀察；取雙側(cè)坐骨神經(jīng),分別行石蠟包埋后行HE染色和樹脂包埋后行亞甲藍染色,光鏡下對再生神經(jīng)進行組織形態(tài)學(xué)觀察。 4、在大量動物實驗基礎(chǔ)上,制定了產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn),并通過了國家醫(yī)療器械天津檢測中心的檢測后,應(yīng)用可吸收誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)材料修復(fù)人類粗大周圍神經(jīng)缺損,術(shù)后綜合感覺、運動功能檢查,電生理檢查及高頻B超檢查評價神經(jīng)功能恢復(fù)情況。 四、結(jié)果 1、成功從大鼠骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)10天后細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣的長梭形,胞核卵圓形,胞漿豐富,彼此融合成片。應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子可在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,免疫組化結(jié)果表明細(xì)胞表達神經(jīng)元特異標(biāo)記蛋白神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲蛋白及突觸囊泡膜特異性蛋白質(zhì)突觸素蛋白,證明該細(xì)胞不僅形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,而且分子水平也隨之發(fā)生改變。 2、動物實驗結(jié)果 2.1術(shù)后大體觀察：手術(shù)切口均一期愈合,皮膚未見紅腫,無異物反應(yīng)。至實驗完成,所有動物存活。術(shù)后2周起,各組大鼠患側(cè)肢體出現(xiàn)拖地行走、跛行、足部皮膚紅腫及足跟潰瘍等神經(jīng)營養(yǎng)障礙表現(xiàn),隨時間延長逐漸恢復(fù)。術(shù)后患側(cè)小腿三頭肌逐漸萎縮,D組萎縮程度較其他3組輕。 2.2坐骨神經(jīng)功能指數(shù)：A、B、C、D組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)分別為-75.15+4.54、-66.99±4.76、-65.75±5.20、-63.33+3.82,B、C、D組高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001),B、C、D組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 2.3電生理檢測：術(shù)后3個月刺激神經(jīng)干,記錄能引起各組動作電位的刺激電極與接受電極距離、潛伏期并計算出傳導(dǎo)速度。術(shù)后3個月各組大鼠患側(cè)均可引出復(fù)合肌肉動作電位,B組神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；C、D組均高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)；B組與A組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；C組和D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 2.4小腿三頭肌濕重恢復(fù)率：各組大鼠患側(cè)肌肉不同程度萎縮, B、C、D組小腿三頭肌恢復(fù)率均明顯高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)；D組高于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；B、D組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 2.5組織形態(tài)學(xué)觀察 2.5.1小腿三頭肌HE染色：正常小腿三頭肌肌纖維為多邊形,大小、形態(tài)均一、規(guī)則,細(xì)胞核緊靠肌膜；D組肌纖維形態(tài)規(guī)則,與正常肌肉相似；C組肌纖維直徑較D組小,肌纖維排列較密集,肌束間可見少量疏松結(jié)締組織；B組大部分肌纖維呈圓形或橢圓形,肌束間可見較多纖維組織；A組肌纖維形態(tài)多樣,大小不一,可見少許細(xì)小肌纖維散在分布,細(xì)胞核多,染色反應(yīng)強,肌束間有大量疏松結(jié)締組織。B、C、D組肌細(xì)胞橫截面積恢復(fù)率均高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)；D組高于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)；B、D組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 2.5.2再生神經(jīng)大體觀察：取材時見導(dǎo)管與周圍組織無明顯粘連,管壁變薄,管內(nèi)有連續(xù)性再生神經(jīng)通過,表面可見營養(yǎng)血管爬行生長,直徑較正常神經(jīng)細(xì)。導(dǎo)管植入部位無明顯滲液、膿腫等不良反應(yīng)。 2.5.3再生神經(jīng)HE染色示C、D組神經(jīng)纖維致密,連續(xù)性好,排列整齊,髓鞘清晰,可見無髓鞘包裹的郎飛氏結(jié)(Ranvier、snode):A.B組神經(jīng)纖維比C、D組稀疏,排列較整齊。亞甲藍染色：D組神經(jīng)外膜完整,有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多,大小均勻,排列緊密,髓鞘厚,成熟良好,并開始出現(xiàn)分束；C組見再生有髓纖維,形態(tài)與D組相似；B組再生的神經(jīng)纖維較稀疏、髓鞘較薄,排列較整齊；A組再生纖維細(xì)小,髓鞘薄,數(shù)量少,分布松散,血管和纖維結(jié)締組織多,神經(jīng)排列紊亂。A組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量、直徑及髓鞘厚度與B、C、D組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001),B、C、D組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。D組有髓神經(jīng)纖維直徑及髓鞘厚度高于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。B、D組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 3、臨床試驗結(jié)果 15例患者術(shù)后隨訪6月～23月,平均13.1月。所有患者傷口均一期愈合,無感染、滲出等不良反應(yīng)。其中11例患者術(shù)后感覺與運動功能不同程度恢復(fù),改善率達73.3%,等同于同類產(chǎn)品的臨床性能；根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會手外科學(xué)會上肢周圍神經(jīng)功能評定試用標(biāo)準(zhǔn)進行評分,優(yōu)5例,良4例,可2例,無明顯改善4例。術(shù)后肌電圖檢查確定11例患者神經(jīng)傳導(dǎo)功能有恢復(fù)；高頻超聲顯示植入導(dǎo)管在位,未見與周圍組織明顯粘連。 五、結(jié)論 1、聯(lián)合利用堿性成纖維生長因子和表皮生長因子可在體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,但這些細(xì)胞是否具備成熟神經(jīng)元的傳導(dǎo)功能尚需進一步研究。 2、PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF復(fù)合BMSC-NCs能成功修復(fù)大鼠12mm坐骨神經(jīng)缺損,修復(fù)效果與自體神經(jīng)移植相近。 3、PRGD/PDLLA/β-TCP復(fù)合型神經(jīng)導(dǎo)管應(yīng)用于臨床修復(fù)周圍神經(jīng)缺損,療效等同于同類產(chǎn)品的臨床性能,能有效促進周圍神經(jīng)再生,未見不良反應(yīng),可作為周圍神經(jīng)損傷較理想的替代療法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.3

【參考文獻】

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本文編號：2384065