【摘要】：第一部分黃芪主要有效成分對Aβl誘導(dǎo)阿爾茨海默病模型大鼠的保護(hù)作用研究目的：阿爾茨海默病(AD)是一種慢性進(jìn)展性中樞神經(jīng)退行性疾病,臨床多發(fā)于老年人。其主要病理特征包括神經(jīng)元間p淀粉樣蛋白(Ap)沉積形成老年斑(SP),神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成纖維纏結(jié)(NFTs)以及特定腦區(qū)中樞膽堿能神經(jīng)元的大量死亡與丟失。隨著社會人口老齡化日益嚴(yán)重,AD對人類健康的危害日趨嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì),在歐美國家AD已成為繼心臟病、癌癥、卒中之后的第4位死因,而在中國AD患者的人數(shù)己超過500萬。因而,AD的防治已成為當(dāng)前社會亟待解決的重大醫(yī)學(xué)和社會問題之一。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制研究,尚不十分清楚。大量研究證據(jù)支持Ap異常沉積導(dǎo)致的級聯(lián)反應(yīng)損傷學(xué)說,而在此過程中,氧化應(yīng)激機(jī)制是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。因而,本研究從中藥黃芪有效成分黃芪總苷及黃芪甲苷,對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和氧化應(yīng)激的作用為切入點(diǎn),揭示黃芪主要有效成分防治AD的可能機(jī)制,為其用于臨床治療提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。方法：選用成年雄性SD大鼠(體重250～300 g),以側(cè)腦室注射Ap25-35制備海馬損傷模擬大鼠AD模型。大鼠隨機(jī)分組,分為對照組(假手術(shù)組)、模型組、黃芪總苷低劑量組(20mg/kg)、黃芪總苷中劑量組(40 mg/kg)、黃芪總苷高劑量組(80 mg/kg)黃芪甲苷組(50 mg/kg),每組各12只。在模型組和治療組,采用側(cè)腦室注射聚集態(tài)Ap25-35的方法制備AD大鼠模型。用無菌生理鹽水將Ap25-35稀釋成3 nmol/L的工作液,密封后放置于37℃無菌恒溫培養(yǎng)箱中孵育1周,使其變成聚集狀態(tài)。通過腦立體定位儀向大鼠側(cè)腦室注入聚集態(tài)Aβ25-35 5 μ1(15 μg)；向假手術(shù)組側(cè)腦室中注入等量的無菌生理鹽水。手術(shù)后開始灌胃給藥,連續(xù)21 d,模型組、對照組給予等量的生理鹽水。手術(shù)后一周開始進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練,連續(xù)5 d；手術(shù)后第14 d進(jìn)行測試共記錄3 d,觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化,分析各組大鼠逃避潛伏期、游泳總距離、跨臺次數(shù)及搜索策略的差異。Morris水迷宮測試后,部分大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,以4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定,取腦組織制作冰凍切片。以尼氏染色觀察海馬區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,免疫組織化學(xué)法觀察海馬區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的變化,Hoechst33342染色檢測神經(jīng)元凋亡情況。部分大鼠在完成Morris水迷宮測試后,立即斷頭取腦制備海馬組織勻漿,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),檢測海馬組織勻漿中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 15.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)分析或非配對t-檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.水迷宮實(shí)驗(yàn)(1)水迷宮定位航行在Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)中,正常組和假手術(shù)組大鼠比模型組和治療組大鼠更容易搜索并找到安全平臺。在測試第1天,Aβ組大鼠尋找安全平臺的逃避潛伏期明顯延長(P0.05),游泳總距離明顯延長(P0.01)；在黃芪總苷低劑量組,逃避潛伏期和游泳總路程有縮短趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在黃芪總苷中劑量組、高劑量組和黃芪甲苷組,逃避潛伏期明顯縮短(P0.01),而游泳總路程有縮短趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從測試第2天開始,與模型組比較,黃芪總苷低、中、高劑量組和黃芪甲苷組的逃避潛伏期均明顯縮短；黃芪總苷高劑量組和黃芪甲苷組游泳總距離較模型縮短(P0.05),而黃芪總苷低、中劑量組游泳總距離未發(fā)現(xiàn)明顯差異。在測試第3天,與模型組比較,除黃芪總苷低劑量組外,其余各治療組逃避潛伏期及游泳總距離與模型組相比均有顯著性差異(P0.05)。(2)水迷宮空間搜索能力與對照組相比,模型組大鼠在平臺的停留時間明顯延長(P0.05)；與模型組比較,黃芪總苷中劑量組、高劑量組大鼠在搜索平臺停留時間明顯縮短(P0.05),黃芪甲苷組大鼠在搜索平臺停留時間明顯縮短(P0.05)。與對照組相比,模型組大鼠跨平臺次數(shù)明顯減少(P0.05),黃芪總苷中劑量組、高劑量組大鼠跨平臺次數(shù)明顯增多,但未恢復(fù)到正常水平,黃芪甲苷組大鼠跨平臺次數(shù)明顯增多(P0.05)。與模型組比較,黃芪總苷低劑量組大鼠在平臺停留時間和跨平臺次數(shù)未發(fā)現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對照組相比較,模型組大鼠搜索策略評分明顯降低(P0.05),黃芪總苷中劑量組和高劑量組較模型組搜索策略評分均明顯增加(P0.05)；與模型組相比,黃芪甲苷組搜索策略評分也明顯增高(P0.05)。2.病理組織學(xué)所見(1)尼氏染色正常組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密,胞內(nèi)尼氏小體豐富,染色較深,核呈淡藍(lán)色；與對照組比較,模型組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞染色變淺,尼氏小體數(shù)目減少,細(xì)胞排列稀疏,細(xì)胞間隙增大,分界不清；黃芪總苷各治療組及黃芪甲苷組細(xì)胞數(shù)目有所增多,細(xì)胞間隙變小,神經(jīng)元水腫有所減輕。(2)免疫熒光染色免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對照組相比較,AD大鼠模型組海馬區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物(NeuN)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P0.05),黃芪總苷中劑量組、高劑量組和黃芪甲苷組較模型組大鼠海馬區(qū)域NeuN陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.05)；提示黃芪總苷及黃芪甲苷對Ap誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。3.氧化應(yīng)激檢測所見(1) GSH-Px活性ELISA結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬組織勻漿GSH-Px活性較對照組明顯降低(P0.05)；黃芪總苷中劑量組和高劑量組大鼠較模型組GSH-Px活性顯著增高(P0.05),黃芪總苷低劑量組GSH-Px活性變化不明顯；黃芪甲苷組大鼠海馬GSH-Px活性明顯增高(P0.01)。(2)SOD活性ELISA結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬組織勻漿SOD活性較對照組明顯下降(P0.05)；黃芪總苷高劑量組大鼠海馬SOD活性較模型組顯著升高(P0.05),黃芪總苷低劑量組和中劑量組大鼠海馬SOD活性有所升高,但統(tǒng)計(jì)無顯著性差異,黃芪甲苷組大鼠海馬SOD活性升高不明顯(P0.05)。(3)MDA含量ELISA結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬組織勻漿MDA含量較對照組明顯升高(P0.01)；黃芪總苷各劑量組大鼠海馬MDA含量較模型組顯著減低(P0.01)；黃芪甲苷組大鼠海馬MDA含量較模型組也顯著降低(P0.05)。結(jié)論：1.黃芪總苷及黃芪甲苷能夠改善Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。2.側(cè)腦室注射Aβ25-35后,大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元密度明顯減少,凋亡細(xì)胞明顯增多,連續(xù)給予黃芪總苷及黃芪甲苷干預(yù)3周后,能夠顯著減輕Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。3.Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)域的氧化應(yīng)激損傷,黃芪總苷能夠顯著增加抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性,降低海馬組織MDA的含量,黃芪甲苷也能顯著增加SOD活性,降低海馬組織MDA含量,提示黃芪總苷及黃芪甲苷具有抗氧化以及保護(hù)大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激的作用。綜上所述,黃芪總苷及黃芪甲苷改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,可能通過其抗氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。第二部分 黃芪主要有效成分對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用目的：黃芪為豆科黃芪屬植物,其主要有效成分具有益氣升陽、利水消腫等功效,具有顯著的抗氧化作用。本研究選用神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象,采用Aβ25-35處理PC12細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷,并檢測黃芪主要有效成分黃芪總苷及黃芪甲苷是否對Ap誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,是否通過抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)揮作用。方法：1.以聚集態(tài)的Aβ25-35處理PC12細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)損傷,建立體外模擬AD樣損傷細(xì)胞模型。2.黃芪總苷及黃芪甲苷預(yù)處理后,觀察藥物處理對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：(1)MTT法檢測黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用；(2)乳酸脫氫酶(LDH)法檢測黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞損傷的影響；(3) Hoechst 33342法觀察黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞凋亡的影響；(4)流式細(xì)胞技術(shù)檢測黃芪總苷及黃芪甲苷預(yù)處理對活性氧簇(ROS)平均熒光強(qiáng)度的影響；(5) ELISA法檢測黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞中抗氧化酶GSH-Px和SOD活性及氧化物MDA含量等的影響；(6)RT-PCR法檢測黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞iNOS mRNA的影響。結(jié)果：1.黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞損傷的影響MTT法結(jié)果顯示,不同濃度的黃芪總苷及黃芪甲苷(5、10、20、40、80、 100 μg/ml)對PC12細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用,也不影響細(xì)胞增殖。不同濃度聚集態(tài)AP25-35 (2.5、10、20、40μM24 h后,細(xì)胞存活率均明顯下降,10 μM Aβ25-35作用24 h細(xì)胞存活率下降為65%,以此作為PC12細(xì)胞損傷的最佳作用濃度。黃芪總苷各濃度均能明顯增加Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率下降,與模型組相比,不同濃度黃芪甲苷5、 10、 20、40、80 μg/ml)均能顯著增加PC12細(xì)胞存活率(P0.01)。LDH檢測結(jié)果顯示,10 μM Aβ25-35作用24 h PC12細(xì)胞上清液LDH釋放明顯增加,黃芪總苷(5、10、20、40、80 μg/ml)均能顯著抑制上清液中LDH釋放,黃芪甲苷(5、1O、20、40、80 μg/ml)也能明顯抑制PC12細(xì)胞上清液中LDH釋放·(P0.01)。2.黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33342染色結(jié)果顯示,與對照組相比,10 μM AP25-35作用24 h后細(xì)胞內(nèi)凋亡小體明顯增加,核固縮現(xiàn)象明顯；與模型組相比,黃芪總苷10、40μM預(yù)處理能明顯減少細(xì)胞凋亡,核固縮現(xiàn)象明顯減少,黃芪甲苷10、40μM預(yù)處理也能明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡3.黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比較,10 μM Aβ25-35作用24 h后,PC12細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶GSH-Px和SOD活力明顯下降(P0.01),黃芪總苷各濃度(5、10、20、40、80μM)均能明顯增加GSH-Px和SOD活力,黃芪甲苷各濃度(5、10、20、40、80 μM)也能顯著抑制GSH-Px和SOD的活力下降(P0.01)。Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞MDA含量增加,與模型組比較,黃芪總苷預(yù)處理抑制PC12細(xì)胞損傷后MDA的釋放,黃芪甲苷預(yù)處理也能顯著降低MDA的含量(P0.01)。4.黃芪總苷及黃芪甲苷對PC12細(xì)胞iNOS RNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示,10 μM Aβ25-35作用24 h誘導(dǎo)PC12細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)顯著上調(diào),與模型組相比,黃芪總苷(10、40μM)預(yù)處理均顯著抑制PC12細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá),黃芪甲苷(10、40μM)也能明顯降低PC12細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)(P0.01)。結(jié)論：Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性明顯降低,LDH釋放增加,細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激增加。黃芪總苷及黃芪甲苷通過抑制PC12細(xì)胞活性降低和LDH釋放增加,抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激增加而發(fā)揮保護(hù)作用；Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞iNOS表達(dá)上調(diào)也被黃芪總苷及黃芪甲苷所抑制。第三部分黃芪主要有效成分對H202誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究目的：為進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪主要有效成分黃芪總苷及黃芪甲苷的抗氧化作用,該部分旨在檢測在神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞中,觀察黃芪總苷及黃芪甲苷對H202誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用,并初步比較兩者的抗氧化效果。方法：在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中,加入300 μM H2O2作用不同時間觀察細(xì)胞活力的變化時相,確定H202損傷PC12細(xì)胞模型的最佳作用條件。給予黃芪總苷及黃芪甲苷預(yù)處理,采用MTT法和LDH檢測反映PC12細(xì)胞存活率和LDH漏出率的變化,比較黃芪總苷及黃芪甲苷的作用效果差異。300 μM H2O2作用時間為4h時,細(xì)胞活力下降到約70%,故選取300 μM H2O2作用時間4 h作為建立H202損傷PC12細(xì)胞模型的適宜條件,用于后續(xù)試驗(yàn)。結(jié)果：300 μM H2O2處理PC12細(xì)胞后,隨時間延長細(xì)胞活力逐漸下降,兩者呈現(xiàn)正相關(guān)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組細(xì)胞存活率顯著下降；與模型組比較,黃芪總苷(10、20、40 μM)和黃芪甲苷(10、20、40μM)預(yù)處理能明顯增加細(xì)胞存活率(P0.01)。LDH檢測結(jié)果顯示,H2O2作用4 h明顯增加LDH的釋放,與模型組比較,黃芪總苷(10、20、40μM)明顯抑制H202誘導(dǎo)LDH釋放增加；黃芪甲苷(10、20、40μM)也能明顯抑制H202誘導(dǎo)LDH釋放增加(P0.01)；與黃芪總苷比較,相同濃度的黃芪甲苷抑制LDH釋放的效果更明顯。結(jié)論：H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性明顯下降,LDH釋放增加,黃芪總苷及黃芪甲苷能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活性下降和LDH釋放增加,表明對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。論文總結(jié)1.黃芪總苷及黃芪甲苷能夠改善Aβ25-35誘導(dǎo)的AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。2.黃芪總苷及黃芪甲苷顯著減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的AD大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷。3.Aβ25-35側(cè)腦室注射降低海馬組織的GSH-Px和SOD活性,上調(diào)海馬MDA含量,黃芪總苷及黃芪甲苷預(yù)處理能夠顯著抑制GSH-Px和SOD活性降低和MDA含量增加。4.黃芪總苷及黃芪甲苷對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,并通過抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮作用。5.Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞iNOS RNA表達(dá)上調(diào),黃芪總苷及黃芪甲苷能夠抑制iNOS RNA表達(dá)上調(diào)。6.黃芪總苷及黃芪甲苷對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285;R284

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡清宇;;黃芪總苷的提取及藥理作用的研究[J];科技信息(學(xué)術(shù)研究);2007年05期

2 李君安;張國元;凡瞿明;張翼冠;;黃芪總苷對兔動脈粥樣硬化斑塊中平滑肌表達(dá)的影響[J];中藥藥理與臨床;2009年03期

3 黃可兒;趙敏;王建華;;黃芪總苷的藥理研究進(jìn)展[J];中藥新藥與臨床藥理;2005年06期

4 孫海燕;黃民;關(guān)溯;;黃芪總苷對實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎的保護(hù)作用[J];時珍國醫(yī)國藥;2006年10期

5 古平;何民;;黃芪總苷對實(shí)驗(yàn)性貓急性心衰的治療作用[J];西南國防醫(yī)藥;2008年03期

6 吳慶四;劉東梅;徐東芳;姚余有;李衛(wèi)平;;黃芪總苷對地塞米松和β-淀粉樣蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響[J];中草藥;2010年11期

7 朱慧淵;;黃芪總苷對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的影響[J];山東中醫(yī)雜志;2013年05期

8 盧煒卓;;黃芪總苷對大鼠腦缺血機(jī)制與前列腺素的關(guān)系[J];安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報;2007年04期

9 許杜娟,吳強(qiáng),楊雁,陳敏珠;黃芪總苷的抑瘤作用及其作用機(jī)制[J];中國藥理學(xué)通報;2003年07期

10 王令杰;孫響波;于妮娜;孟昭陽;;淺析黃芪在心系疾病中的應(yīng)用[J];湖南中醫(yī)雜志;2014年02期

相關(guān)會議論文 前6條

1 余俊先;劉sセ，

本文編號：2371309