【摘要】：研究背景 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊多發(fā)生在大血管的分叉和彎曲處等渦流及病理震蕩剪切力作用區(qū)域,而在大血管直行區(qū)域,平穩(wěn)血流對(duì)血管壁產(chǎn)生單向的、大小高于震蕩剪切力的生理脈沖剪切力。血管內(nèi)皮細(xì)胞是在血管對(duì)剪切力的應(yīng)答過程中起最重要作用的細(xì)胞。大量研究表明,紊亂的血流會(huì)通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖等促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展,而脈沖剪切力則使內(nèi)皮細(xì)胞保持較低的增殖水平、較低的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)水平,維持其相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展。 程序性細(xì)胞死亡4(Programmed Cell Death4, PDCD4)主要通過抑制腫瘤蛋白的翻譯過程起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。PDCD4蛋白可直接與靶基因(MYB/c-MYB)的mRNA編碼區(qū)域結(jié)合或通過與真核細(xì)胞翻譯起始因子(Eukaryotic Translation Initiation Factor, eIF)4G競爭性結(jié)合eIF4A抑制靶蛋白的翻譯起始過程。通過該機(jī)制,PDCD4可以影響多種蛋白的表達(dá),從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、侵襲以及自噬等生物學(xué)行為。PDCD4抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體作用及機(jī)制因腫瘤和細(xì)胞種類的不同而有所差異。 近期研究發(fā)現(xiàn),PDCD4還影響心血管系統(tǒng)各類細(xì)胞的生物學(xué)功能。但是,在血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持中PDCD4發(fā)揮怎樣的作用尚無研究報(bào)道。 在對(duì)PDCD4和載脂蛋白E (Apolipoprotein E, ApoE)雙基因敲除小鼠(PDCD4-/-ApoE-/-)的研究中發(fā)現(xiàn),PDCD4基因的敲除可明顯減少血管壁的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,說明PDCD4有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用,具體機(jī)制尚不明確。 研究目的 (1)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)明確不同剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4表達(dá)的影響； (2)明確PDCD4對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響； (3)明確PDCD4在不同剪切力引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡中的作用. 研究方法 1.小鼠主動(dòng)脈的en face免疫熒光染色 C57BL/6、鼠經(jīng)腹腔注射深度麻醉后,灌注,固定,分離主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈,去除周圍結(jié)締組織,縱向剖開主動(dòng)脈弓,封閉后,兩種一抗共同孵育4℃過夜,不同熒光標(biāo)記的兩種相應(yīng)二抗共同37℃避光孵育,封片,共聚焦顯微鏡下觀察。 2.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的提取和培養(yǎng) 無菌條件下獲取剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,用胰酶消化法獲取HUVECs,用20%M199培養(yǎng)基(20%胎牛血清+400μl/ml貝復(fù)濟(jì)+青-鏈霉素)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),一代之后換10%M199培養(yǎng)基(10%胎牛血清+400μl/ml貝復(fù)濟(jì)+青-鏈霉素)培養(yǎng)。 3.體外剪切力干預(yù) 體外培養(yǎng)的4-8代HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的培養(yǎng)載片上,經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,繼續(xù)靜止培養(yǎng)或給予0、1、3、6、9、12小時(shí)的脈沖或震蕩剪切力刺激,觀察剪切力對(duì)HUVECs中PDCD4表達(dá)以及細(xì)胞功能的影響,不同剪切力描述如下： (1)脈沖剪切力：12dyne/cm2大小,頻率為1Hz； (2)震蕩剪切力：0±4dyne/cm2大小,頻率為1Hz。 4.蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting,WB) 提取細(xì)胞蛋白,煮沸,經(jīng)SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗4℃C孵育過夜,相對(duì)應(yīng)的二抗孵育,化學(xué)發(fā)光法發(fā)光后,分析蛋白條帶灰度值。 5.免疫熒光染色 給予培養(yǎng)載片上培養(yǎng)的HUVECs以12小時(shí)的脈沖剪切力、12小時(shí)的震蕩剪切力或靜止培養(yǎng)作對(duì)照,經(jīng)固定、打孔、封閉、一抗4℃孵育過夜、熒光標(biāo)記二抗37℃避光孵育、染核、封片后,共聚焦顯微鏡下觀察不同組內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá)差異。 6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染 p-EGFP-C1-PDCD4和p-EGFP-C1-Mock質(zhì)粒來自紐約大學(xué)Olubunmi Afonja博士的友情饋贈(zèng),分別用于HUVECs中過表達(dá)PDCD4和陰性對(duì)照。PDCD4的小干擾核糖核酸(Small Interfering RNA, siRNA)和Negative Control購自上海吉瑪公司,序列如下： 質(zhì)粒和siRNA的轉(zhuǎn)染均采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,步驟遵照Lipo-2000說明書進(jìn)行。 7.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)法檢測PDCD4在剪切力調(diào)節(jié)HUVECs增殖中的作用 HUVECs的增殖功能檢測運(yùn)用BrdU法,所用試劑盒為美國羅氏公司的BrdU標(biāo)記及檢測試劑盒I (Cat. No.11296736001),實(shí)驗(yàn)步驟遵照試劑盒說明書進(jìn)行：將HUVECs種在培養(yǎng)載片上進(jìn)行不同刺激和處理,在刺激結(jié)束前6小時(shí)以1：1000的比例向培養(yǎng)基中加入BrdU labeling medium,刺激結(jié)束后用95%乙醇固定,經(jīng)anti-BrdU4℃孵育過夜、Anti-mouse-Ig-fluorescei或nAlexa flour647標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫熒光二抗37℃避光孵育、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, DAPI)染核后封片,共聚焦顯微鏡下觀察不同組HUVECs增殖功能的差異,計(jì)數(shù)并計(jì)算BrdU陽性細(xì)胞率。 8.脫氧核苷末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測PDCD4在剪切力調(diào)節(jié)HUVECs凋亡中的作用 HUVECs的凋亡情況檢測運(yùn)用TUNEL法,所用試劑盒為美國Millipore公司的ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Cat. No. S7101),實(shí)驗(yàn)步驟遵照試劑盒說明書進(jìn)行：將HUVECs種在培養(yǎng)載片上培養(yǎng),予以不同刺激和處理,之后依次經(jīng)免疫染色固定液固定、預(yù)冷的乙醇／乙酸液(乙醇：乙酸=2：1)-20℃C孵育、TdT酶37℃孵育、抗異羥基洋地黃毒苷過氧化物酶結(jié)合液室溫孵育、二氨基聯(lián)苯胺(3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydroch-loride, DAB)顯色、甲基綠染核、脫水封片后鏡下觀察不同組HUVECs凋亡的差異,計(jì)數(shù)并計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞率。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)的形式表示,使用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的比較運(yùn)用單因素方差分析,P0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。 研究結(jié)果 1.小鼠體內(nèi)促動(dòng)脈粥樣硬化血流作用區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá)量高于抗動(dòng)脈粥樣硬化血流作用區(qū)域 胸主動(dòng)脈直段的內(nèi)皮細(xì)胞受抗動(dòng)脈粥樣硬化的脈沖剪切力作用,呈長梭狀,沿血管長軸規(guī)律排列,而主動(dòng)脈弓小彎側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞受促動(dòng)脈粥樣硬化的震蕩剪切力及低剪切力作用,呈多向不規(guī)則狀排列。主動(dòng)脈弓小彎側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá)量(以熒光強(qiáng)度表示)高于胸主動(dòng)脈直段內(nèi)皮細(xì)胞(P0.05),說明在體內(nèi),抗動(dòng)脈粥樣硬化的剪切力下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá),而促動(dòng)脈粥樣硬化的剪切力則上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá)。 2.脈沖剪切力下調(diào)HUVECs中PDCD4的表達(dá),震蕩剪切力上調(diào)HUVECs中PDCD4的表達(dá) 脈沖剪切力作用下的內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4蛋白水平隨時(shí)間延長而逐漸下調(diào),與靜止對(duì)照組(0小時(shí)組)比較,脈沖剪切力作用3小時(shí)至12小時(shí)PDCD4蛋白水平下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在震蕩剪切力作用下,PDCD4蛋白水平隨時(shí)間延長而逐漸上調(diào),與靜止對(duì)照組(0小時(shí)組)比較,震蕩剪切力作用6小時(shí)至12小時(shí)PDCD4蛋白上調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光染色結(jié)果也顯示,脈沖剪切力作用后HUVECs中PDCD4的含量明顯降低(P0.05),而震蕩剪切力作用后HUVECs中PDCD4的含量明顯升高(P0.05)。 3. PDCD4促進(jìn)HUVECs的增殖和凋亡 與空載體對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-PDCD4以過表達(dá)PDCD4下調(diào)p21Wafl/cip1的表達(dá)(P0.05),促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P0.05)；而轉(zhuǎn)染siRNA將PDCD4沉默,與陰性對(duì)照組比較,則上調(diào)p21Wafl/Cip1的表達(dá)(P0.05),抑制細(xì)胞的增殖(P0.05),表明PDCD4促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。 與對(duì)照組比較,過表達(dá)PDCD4上調(diào)激活的Caspase-3(P.05),促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(P0.05),而沉默PDCD4,與陰性對(duì)照組比較,則抑制激活的Caspase-3(P0.05),抑制細(xì)胞的凋亡(P0.05),表明PDCD4促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 4. PDCD4參與不同剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié),不參與其對(duì)凋亡的調(diào)節(jié) 與靜止對(duì)照組比較,脈沖剪切力上調(diào)p21Wafl/Cipl的表達(dá)(P0.05),抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(P0.05)；而過表達(dá)PDCD4,與空載體陰性對(duì)照組比較,能夠阻斷脈沖剪切力對(duì)p21Waf1/cip1的促進(jìn)(P0.05)和對(duì)增殖的抑制作用(P0.05)。 與靜止對(duì)照組比較,震蕩剪切力抑制21Wafl/Cipl的表達(dá)(P0.05),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(P0.05)；而沉默PDCD4,與陰性對(duì)照組比較,能夠阻斷震蕩剪切力對(duì)p2iWaf1/Cipl的抑制(P0.05)和對(duì)增殖的促進(jìn)作用(P0.05)。 與靜止對(duì)照組比較,脈沖剪切力抑制激活的Caspase-3(P0.05),抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(P0.05)；但過表達(dá)PDCD4,與空載體陰性對(duì)照組比較,不能阻斷脈沖剪切力對(duì)對(duì)激活的Caspase-3的抑制及對(duì)凋亡的抑制。 與靜止對(duì)照組比較,震蕩剪切力促進(jìn)激活的Caspase-3(P0.05),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(P0.05)；但沉默PDCD4,與陰性對(duì)照組比較,不能阻斷震蕩剪切力對(duì)激活的Caspase-3及對(duì)凋亡的促進(jìn)。 以上結(jié)果表明,PDCD4參與不同剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié),但是不參與其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。 結(jié)論 (1)脈沖剪切力下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá),而震蕩剪切力上調(diào)其表達(dá)； (2) PDCD4促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡； (3)PDCD4參與不同剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用,不參與剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。 研究背景 血流流經(jīng)血管管腔產(chǎn)生剪切力作用于血管壁內(nèi)表面的內(nèi)皮細(xì)胞,激活血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜上以及周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的相關(guān)受體,改變細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響多種基因表達(dá)和蛋白活性,維持血管內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。在血管彎曲、分叉及狹窄處,血流受到干擾,剪切力由脈沖和層流剪切力變?yōu)檎鹗幍牡图羟辛?引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,使這些部位成為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的好發(fā)部位。 近期研究發(fā)現(xiàn),抑癌基因程序性細(xì)胞死亡4(Programmed Cell Death4, PDCD4)在心血管系統(tǒng)中同樣發(fā)揮重要作用,如抑制血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡等。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)PDCD4能同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡。我們?cè)隗w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)剪切力能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的蛋白含量,但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明了。 對(duì)眾多腫瘤細(xì)胞和一些心血管系統(tǒng)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),微小核糖核酸-21(microRNA-21, miR-21)與PDCD4的表達(dá)負(fù)相關(guān)。在PDCD4基因的3’非編碼區(qū)有一個(gè)保守的miR-21結(jié)合位點(diǎn),miR-21可直接與PDCD4的信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid, mRNA)結(jié)合抑制其表達(dá)。同時(shí),其他研究發(fā)現(xiàn)腫瘤刺激物12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)以及給饑餓處理的細(xì)胞重新添加血清均可引起PDCD4蛋白的泛素化降解。以上兩條途徑均在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)PDCD4進(jìn)行調(diào)節(jié),而PDCD4在轉(zhuǎn)錄水平是如何被調(diào)節(jié)的鮮有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠的pdcd4基因序列中有一個(gè)可能的核轉(zhuǎn)錄因子κB (Nuclear Factor kappa B, NF-κB)結(jié)合位點(diǎn),但該位點(diǎn)是否發(fā)揮作用尚不清楚。目前為止,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究很少且存在爭議。 剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4表達(dá)的機(jī)制尚不明確,而niR-21、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)及其他途徑是否參與介導(dǎo)剪切力的作用也有待研究證實(shí)。 研究目的 (1)明確泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在不同剪切力調(diào)節(jié)HUVECs PDCD4表達(dá)中的作用； (2)明確miR-21在HUVECs中對(duì)PDCD4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用； (3)明確NF-κB在震蕩剪切力上調(diào)HUVECs PDCD4表達(dá)中的作用。 研究方法 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的提取和培養(yǎng) 無菌條件下獲取剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,胰酶消化法獲取HUVECs,20%培養(yǎng)基(20%胎牛血清+400μl/ml貝復(fù)濟(jì)+青-鏈霉素)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一代之后更換10%培養(yǎng)基(10%胎牛血清+400μl/ml貝復(fù)濟(jì)+青-鏈霉素)培養(yǎng)。 2.體外剪切力干預(yù) 體外培養(yǎng)的4-8代HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的Flexcell培養(yǎng)載片上,經(jīng)10%培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,予以適當(dāng)處理,繼續(xù)靜止培養(yǎng)或給予脈沖或震蕩剪切力刺激,觀察剪切力對(duì)HUVECs中目的蛋白表達(dá)的影響,不同剪切力描述如下： (1)脈沖剪切力：12dyne/cm2大小,頻率為1Hz； (2)震蕩剪切力：0±4dyne/cm2大小,頻率為1Hz。 3.蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting, WB) 提取細(xì)胞蛋白,煮沸,經(jīng)SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗4℃孵育過夜,相對(duì)應(yīng)的二抗孵育,化學(xué)發(fā)光法發(fā)光后,分析蛋白條帶灰度值。 4.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)分析PDCD4mRNA的表達(dá) 給予種在培養(yǎng)載片上的HUVECs以0、1、3、6、9、12小時(shí)的脈沖剪切力或震蕩剪切力后,運(yùn)用TRIzol法提取細(xì)胞總核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA),運(yùn)用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa Code:DRR037A)互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid, cDNA)合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再使用SYBR Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以測定各組內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4mRNA的表達(dá)。 5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染 β轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)包含蛋白(β-Transducin Repeat-Containing Protein, β-TrCP)和p65的小干擾核糖核酸(Small Interfering RNA, siRNA)、microRNA的模擬物(mimics)和抑制物(inhibitor)以及Negative Control (N.C)均購自上海吉瑪公司,序列如下： siRNA及microRNA的模擬物和抑制物的轉(zhuǎn)染均采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,步驟遵照Lipo-2000說明書進(jìn)行。 6.免疫共沉淀 對(duì)種在培養(yǎng)載片上的HUVECs予以刺激后,用Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,取出少量煮沸保存留作對(duì)照,向剩余提取液中加入Protein A/G PLUS Agarose和兔抗PDCD4單抗4℃C孵育過夜后收集瓊脂糖凝膠珠,清洗后加入2×SDS上樣緩沖液煮沸,取上清,進(jìn)行Western Blotting檢測其中相應(yīng)的蛋白相對(duì)含量。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,使用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多組之間的比較采用單因素方差分析,兩組之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),P0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。 研究結(jié)果 1.脈沖剪切力在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)HUVECs中PDCD4的表達(dá) 檢測脈沖剪切力作用時(shí)間梯度下PDCD4的蛋白及mRNA水平,結(jié)果顯示：與未經(jīng)脈沖剪切力作用的0小時(shí)組比較,在脈沖剪切力作用下,PDCD4蛋白水平隨時(shí)間延長而逐漸下調(diào)(P0.05),但是其mRNA水平無明顯變化(P0.05),提示脈沖剪切力對(duì)HUVECs中PDCD4表達(dá)的下調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。 2.脈沖剪切力通過泛素-蛋白酶體通路下調(diào)PDCD4蛋白 在剪切力刺激前1小時(shí)向培養(yǎng)基中加入蛋白酶體抑制劑MG-132(10μM)或乳胞素(10μM),二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide, DMSO)作陰性對(duì)照；將E3配體β-TrCP的siRNA轉(zhuǎn)染入HUVECs中將其沉默。結(jié)果顯示：與DMSO組比較,蛋白酶體抑制劑和(3-TrCP的干擾下調(diào)均可阻斷脈沖剪切力對(duì)PDCD4的下調(diào)(P0.05),但在靜止培養(yǎng)條件下均不影響PDCD4的表達(dá)(P0.05)。免疫共沉淀結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照組和震蕩剪切力組比較,脈沖剪切力明顯增加PDCD4的泛素化(P0.05)。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21的模擬物或抑制物(PTEN為HUVECs中miR-21的靶基因,作陽性對(duì)照),與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照比較,并不影響PDCD4蛋白的表達(dá)(P0.05)。 3.磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidyl Inositol3-Kinase, PI3K)/Akt通路介‘導(dǎo)脈沖剪切力對(duì)PDCD4的降解 在進(jìn)行剪切力刺激之前,用P13K抑制劑ⅠY294002(10μM)預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí),結(jié)果顯示在LY294002作用下,和DMSO組比較,脈沖剪切力引起的Akt磷酸化被阻斷(P0.05),p70-S6K的激活及PDCD4磷酸化也被阻斷(P0.05),從而PDCD4的蛋白水平穩(wěn)定并有上調(diào)趨勢(P0.05)。 4.震蕩剪切力在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HUVECs中PDCD4的表達(dá) 檢測震蕩剪切力作用時(shí)間梯度下PDCD4的蛋白及mRNA水平,結(jié)果顯示：與未經(jīng)震蕩剪切力作用的0小時(shí)組比較,在震蕩剪切力作用下,PDCD4蛋白水平隨時(shí)間延長而逐漸上調(diào)(P0.05),其mRNA水平也上調(diào),在6小時(shí)達(dá)到峰值(P0.05),提示震蕩剪切力對(duì)HUVECs中PDCD4表達(dá)的上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。 5.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)引起的PDCD4降解不參與震蕩剪切力對(duì)PDCD4的上調(diào)作用 在剪切力刺激前1小時(shí)向培養(yǎng)基中加入蛋白酶體抑制劑MG-132(10μM), DMSO作陰性對(duì)照,結(jié)果顯示：與DMSO組比較,蛋白酶體抑制劑并不使PDCD4蛋白表達(dá)量進(jìn)一步增加,反而阻斷震蕩剪切力引起的PDCD4上調(diào)(P0.05),提示震蕩剪切力可能不引起PDCD4的泛素化降解。免疫共沉淀結(jié)果顯示,和靜止對(duì)照組比較,震蕩剪切力未明顯改變PDCD4的泛素化(P0.05)。另外,震蕩剪切力不抑制反而上調(diào)Akt磷酸化(P0.05),上調(diào)程度與脈沖剪切力比較無明顯差別(P0.05),該結(jié)果提示PI3K/Akt通路不參與震蕩剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的上調(diào)。 6. NF-κB參與震蕩剪切力對(duì)PDCD4的上調(diào)作用 在震蕩剪切力刺激前1小時(shí)向培養(yǎng)基中加入NF-κB抑制劑MG-132(10μM), DMSO作陰性對(duì)照；將p65的siRNA轉(zhuǎn)染入HUVECs中將其沉默,結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較, NF-κB抑制劑和p65的干擾下調(diào)均阻斷震蕩剪切力對(duì)PDCD4的上調(diào)(P0.05),表明NF-κB參與震蕩剪切力對(duì)PDCD4的上調(diào)作用。 結(jié)論 (1)脈沖剪切力通過PI3K/Akt通路介導(dǎo)的泛素化降解下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的蛋白； (2)震蕩剪切力在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDCD4的表達(dá),且NF-κB參與其中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 成敏,李毅,陳槐卿,聶永梅,張怡,劉小菁;ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在低切應(yīng)力上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-8基因表達(dá)中的作用[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2005年02期

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本文編號(hào)：2370157