【摘要】：研究背景 槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜和植物的花、葉、果實(shí)中的典型植源性黃酮類化合物，人們?nèi)粘ｏ嬍持械奶O果，沙棘，西蘭花，洋蔥，茶葉等均富含槲皮素。研究表明，槲皮素具有多種重要的生物學(xué)活性如抗氧化，抗血小板聚集，抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，減輕心肌缺血再灌注損傷等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素對大鼠主動脈，腸系膜動脈，門靜脈和豬的冠狀動脈有明顯的舒張作用，然而對大鼠冠狀動脈的舒張作用及其機(jī)制卻未見報(bào)道。 L-型電壓依賴性鈣通道（L-type voltage gated Ca2+channels, LVGC）介導(dǎo)細(xì)胞外鈣跨細(xì)胞膜內(nèi)流，對調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的舒縮生理功能起著至關(guān)重要的作用。鉀通道具有維持細(xì)胞的正常膜電位和調(diào)節(jié)血管張力的功能。血管平滑肌上主要存在4種類型的鉀通道：電壓依賴性鉀通道（voltage-gated K+channels, Kv），鈣激活的鉀通道（Ca2+-activated K+channels, KCa），內(nèi)向整流鉀通道（inwardrectifier K+channels, KIR）和ATP敏感的鉀通道（ATP-activated K+channels, KATP）。其中，Kv通道是表達(dá)最多的鉀離子通道，Kv通道在調(diào)節(jié)細(xì)胞靜息電位和小動脈直徑方面起重要作用。本課題主要研究槲皮素對離體大鼠冠狀動脈的舒張作用及其對離體大鼠心臟冠脈流量和血流動力學(xué)參數(shù)的影響，并進(jìn)一步探討槲皮素舒張大鼠冠脈的作用與LVGC和Kv的關(guān)系。 本課題分三部分進(jìn)行研究： 第一部分槲皮素對離體大鼠冠狀動脈的肌源性反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.觀察槲皮素對大鼠離體冠狀動脈的肌源性反應(yīng)，研究槲皮素對冠狀動脈收縮的抑制作用和對冠狀動脈的舒張作用。 2.在肌源性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，通過利用鉀通道阻斷劑，一氧化氮合酶抑制劑和去內(nèi)皮，探討鉀通道、一氧化氮（nitric oxide, NO）、內(nèi)皮與槲皮素對大鼠冠狀動脈舒張作用的關(guān)系。 3.通過在無鈣液中加入2.5mM CaCl2，觀察槲皮素對細(xì)胞外鈣引起大鼠冠脈血管環(huán)收縮的影響。 實(shí)驗(yàn)方法 離體大鼠冠狀動脈環(huán)肌源性實(shí)驗(yàn)方法： 1.大鼠麻醉后，斷頭，立即取出其心臟，放于4℃O2飽和的HEPES液中。鈍性分離其冠狀動脈，然后剪成長約2mm的血管環(huán)。將兩根直徑為25μm的鋼絲平行穿入血管環(huán)管腔，將血管環(huán)固定于Multi Myograph System-610M微血管張力記錄儀（DMT）上。浴槽內(nèi)含有5.0mLHEPES液體，持續(xù)O2飽和，并維持37℃恒溫。將血管環(huán)前負(fù)荷調(diào)整到80mmHg，平衡1h，平衡期間每隔15min用新鮮的37℃HEPES液更換一次浴槽內(nèi)的液體。血管環(huán)的張力變化通過Chart7.03記錄在計(jì)算機(jī)上。平衡1h后，用60mM KCl收縮血管達(dá)坪臺，再加入乙酰膽堿對血管環(huán)進(jìn)行舒張，連續(xù)刺激血管環(huán)三次，當(dāng)三次的收縮幅度或舒張幅度相差不超過10%時(shí)，認(rèn)為血管反應(yīng)良好，選取收縮達(dá)到2mN或收縮坪臺穩(wěn)定的血管環(huán)進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。 2.向浴槽中累積加入KCl（20，28，39，55，77，108mM）或U46619（0.03，0.1，0.3，1，3μM），制作KCl或U46619的收縮量效曲線，當(dāng)其收縮曲線可重復(fù)時(shí)，向浴液中加入槲皮素（3，10，30μM），孵育15min，然后再次在槲皮素存在的條件下制作KCl或U46619的收縮量效曲線。以未孵育槲皮素前108mMKCl或3μΜ U46619引起的最大收縮幅度為100%，計(jì)算未孵育和孵育槲皮素時(shí)，不同濃度KCl或U46619引起冠脈收縮張力的百分比。 3.用60mM KCl或1μΜ U46619收縮冠脈達(dá)穩(wěn)定的坪臺，向內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮組冠脈血管環(huán)中累積加入濃度梯度的槲皮素（1，3，10，30，100μM）或單純槲皮素溶劑。以60mM KCl或1μΜ U46619收縮達(dá)坪臺時(shí)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算槲皮素或溶劑對大鼠冠脈舒張時(shí)張力所占的百分比。 4.當(dāng)60mM KCl或1μΜ U46619收縮達(dá)穩(wěn)定的坪臺時(shí)，向浴槽中分別加入阻斷劑：電壓依賴性鉀通道阻斷劑（4-aminopyridine,4-AP），大電導(dǎo)鈣激活鉀通道阻斷劑（iberiotoxin, Iber），內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑（BaCl2），ATP敏感的鉀通道阻斷劑（glibenclamide, Glib）及一氧化氮合酶抑制劑（NG-nitro-L-argininemethylester ester, L-NAME），孵育10min，血管收縮再次達(dá)坪臺時(shí)，向浴槽中累積加入不同濃度的槲皮素（1，3，10，30，100μM）舒張冠脈。以60mM KCl或1μΜ U46619收縮達(dá)坪臺時(shí)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算不同濃度槲皮素對大鼠冠脈血管舒張所占的百分比。 5.當(dāng)60mM KCl的收縮幅度可重復(fù)時(shí)，先用含1mM EGTA的無鈣液孵育血管環(huán)20min。當(dāng)血管環(huán)張力恢復(fù)達(dá)基線時(shí)，再用不含EGTA的無鈣液洗脫血管環(huán)，穩(wěn)定10min后，將浴液換為無鈣的60mM KCl或1μΜ U46619孵育10min，向浴槽內(nèi)加入2.5mM CaCl2。向浴槽內(nèi)加入槲皮素（此后槲皮素一直存在于浴液中），孵育15min，然后在無鈣液中加入60mM KCl或1μΜ U46619，10min后，向浴槽內(nèi)加入2.5mM CaCl2。記錄孵育槲皮素前后，無鈣液中60mM KCl或1μΜU46619的收縮幅度以及加入2.5mM CaCl2后冠脈的收縮幅度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1. KCl（20，28，39，55，77，108mM）或U46619（0.03，0.1，0.3，1，3μM）濃度依賴性收縮冠脈，最大收縮幅度分別為4.910.38mN和4.830.41mN，KCl和U46619收縮冠脈的EC50值分別為31.87mM和0.19M。孵育槲皮素（3，10，30M），使KCl和U46619的濃度收縮曲線右下移，槲皮素抑制KCl和U46619收縮量效的IC50值分別為48.8M和88.30M。 當(dāng)孵育槲皮素濃度為3μM時(shí)，KCl或U46619的收縮幅度與對照組相比無顯著性差異（P0.05）；當(dāng)孵育槲皮素濃度為10μM時(shí)，KCl或U46619的最大收縮幅度分別降低了35.4%和21.3%，與對照組相比有顯著性差異（P 0.05）；當(dāng)孵育槲皮素濃度為30μM時(shí)，KCl或U46619的最大收縮幅度分別降低了79.9%和54.7%，與對照組相比有顯著性差異（P 0.05）。 2.槲皮素（1，3，10，30，100μM）濃度依賴性引起內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組冠脈舒張，且內(nèi)皮對槲皮素舒張大鼠冠脈無顯著影響。 在內(nèi)皮完整組實(shí)驗(yàn)中，溶劑對冠脈張力無顯著影響；槲皮素使60mM KCl或1M U46619預(yù)收縮大鼠冠脈的最大張力分別下降了（96.34±7.35）%和（82.47±7.24）%，RC50值分別為22.87M和41.48M。 去內(nèi)皮組與內(nèi)皮完整組相比，槲皮素對60mM KCl或1M U46619預(yù)收縮大鼠冠脈的最大舒張幅度沒有發(fā)生顯著差異（P0.05）。 3. Iber、Glib、BaCl2、L-NAME孵育對槲皮素所致的大鼠冠脈舒張均無顯著性影響（P0.05）；而4-AP（1mM）孵育使槲皮素對KCl預(yù)收縮冠脈的最大舒張幅度減小42.88%（P 0.05）；4-AP（1mM）孵育使槲皮素對U46619預(yù)收縮冠脈的最大舒張幅度減小了28.82%（P 0.05）。 4.在無鈣液中，60mM KCl對大鼠冠脈的張力基本沒有影響，當(dāng)加入2.5mMCaCl2后，，引起冠脈收縮。分別孵育不同濃度的槲皮素（3，10，30M）可濃度依賴性抑制2.5mM CaCl2引起的冠脈收縮，其IC50值為9.55M。在無鈣液中孵育槲皮素（3，10，30M）后，對1M U46619引起的收縮沒有顯著的抑制作用，可濃度依賴性抑制2.5mM CaCl2引起的冠脈收縮，其IC50值為22.5M。 第二部分槲皮素對大鼠離體冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和LVGC電流及Kv電流的影響 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.觀察槲皮素對大鼠冠脈血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 2.觀察槲皮素對大鼠冠脈血管平滑肌細(xì)胞LVGC電流和Kv電流的影響。 實(shí)驗(yàn)方法 1.細(xì)胞分離 利用兩步酶解法分離得到大鼠冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞：首先將冠脈血管置于I號酶解液中，即低鈣的HEPES液（含有0.1mM CaCl2，1mg/mL白蛋白，0.5mg/mL木瓜蛋白酶和1mg/mL二硫丁四醇），在O2飽和且37℃條件下，孵育約30min，然后將冠脈血管轉(zhuǎn)移至II號酶解液中，即無鈣的HEPES液（含有1mg/mL白蛋白，0.5mg/mL膠原蛋白F和0.5mg/mL膠原蛋白H），在O2飽和且37℃條件下，孵育約15min，即得大鼠冠脈血管平滑肌細(xì)胞。 2.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測定 用熒光染料Fluo-4-AM將大鼠冠脈血管平滑肌細(xì)胞染色，依次用正常HEPES液，40mM KCl，40mM KCl+10-100μM槲皮素，正常HEPES液，40mM KCl灌流細(xì)胞，分別記錄不同條件下細(xì)胞的熒光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用相對熒光密度值（F/F0）來反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。 3.電生理學(xué)測量 采用全細(xì)胞電壓鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)，記錄并探討槲皮素對大鼠冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞LVGC電流和Kv電流的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.槲皮素濃度依賴性降低KCl引起的冠脈血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光密度增加。40mM KCl使冠脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光密度增加了97.4%。槲皮素（10，30，100M）降低冠脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光密度百分比分別為30.1%，60.8%和86.5%。 2. Bay K8644（1μM）增大LVGC電流幅度，使峰值電流增加了31.9%；硝苯地平（1μM）抑制LVGC電流幅度，使峰值電流減少了75.6%，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明所記錄電流為LVGC電流。槲皮素（3，10，30μM）濃度依賴性的使冠脈血管平滑肌細(xì)胞LVGC電流的I-V曲線右上移。單獨(dú)給予+10mV單電壓刺激時(shí)，槲皮素（3，10，30μM）抑制LVGC峰值電流的百分比分別為28.7%，57.1%和76.8%。 3.在測試電壓為+60mV時(shí)，冠脈血管平滑肌細(xì)胞KV電流峰值為345.26±23.57pA，電流密度為32.52±5.24pA/pF（n=12）。槲皮素（10，30，100μM）濃度依賴性的使冠脈血管平滑肌細(xì)胞KV電流的I-V曲線上移。單獨(dú)給予+60mV單電壓刺激時(shí)，槲皮素（10，30，100μM）增加KV電流的百分比分別為20.1%，38.1%和73.3%。 第三部分槲皮素對大鼠離體心臟冠脈流量及血流動力學(xué)參數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?利用Langendorff實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察槲皮素對大鼠離體心臟冠脈流量（coronaryflow, CF）及血流動力學(xué)參數(shù)：左心室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure,LVDP），左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP），左心室內(nèi)壓最大上升速率（positive dp/dtmax,+dp/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（negative dp/dtmax,-dp/dtmax）的影響。 實(shí)驗(yàn)方法 利用Langendorff實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，先用臺式液灌流大鼠心臟，記錄冠脈流量及血流動力學(xué)參數(shù)。然后分別用含不同濃度槲皮素（0.3，1，3，10，30μM）的臺式液灌流大鼠心臟，觀察冠脈流量及血流動力學(xué)參數(shù)的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 槲皮素使大鼠離體心臟CF，LVDP，+dp/dtmax和-dp/dtmax值呈濃度依賴性的增大，但對LVEDP值無顯著影響。 1.用正常臺式液灌流時(shí)，CF值為7.8±1.2mL/min，改用含不同濃度槲皮素的臺式液灌流時(shí)，槲皮素（0.3，1，3，10，30μM）濃度依賴性的增大CF值，最大值為13.0±1.3mL/min，其EC50值為3.04μM。 2.離體大鼠心臟LVDP和+dp/dtmax的基礎(chǔ)值分別為：64±3mmHg，1368±124mmHg/s。隨灌流液中槲皮素濃度增加（0.3，1，3，10，30μM），上述兩項(xiàng)指標(biāo)均逐漸增大，最大值分別為：78±2mmHg，1692±196mmHg/s。 3.離體大鼠心臟-dp/dtmax的基礎(chǔ)值為：1143±126mmHg/s。隨灌流液中槲皮素濃度增加（0.3，1，3，10，30μM），-dp/dtmax值逐漸增大，最大值為：1375±151mmHg/s。離體大鼠心臟LVEDP的基礎(chǔ)值為：10±1mmHg，槲皮素對LVEDP值無顯著影響。 全文實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1.槲皮素濃度依賴性舒張大鼠冠狀動脈，其舒張作用是非內(nèi)皮依賴性的，且與增強(qiáng)Kv和抑制LVGC有關(guān)； 2.槲皮素增加離體大鼠心臟冠脈流量，這一結(jié)論與肌源性實(shí)驗(yàn)所得槲皮素舒張大鼠冠脈相一致，且槲皮素對離體大鼠心臟有一定的正性肌力作用。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2368679