【摘要】：背景:心肌梗死是日常和手術(shù)后患者的頭號死因。隨著治療的進(jìn)步,梗死后再灌注損傷的防治成為最大障礙。在圍手術(shù)期,麻醉醫(yī)生對心肌缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)的及時準(zhǔn)確處理,將有助于改善患者的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn),靜脈麻醉藥異丙酚(propofol)預(yù)處理(preconditioning)具有心臟保護(hù)作用,機(jī)制與抗氧化、調(diào)節(jié)ROS/NO信號通路、炎癥和免疫調(diào)節(jié)、激活保護(hù)性信號通路等相關(guān),但特異性靶點和上游激活分子仍不清楚。內(nèi)源性大麻素(endocannabinoids)系統(tǒng)在心臟本身、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)都廣泛存在,能夠調(diào)節(jié)心臟缺血再灌注損傷。異丙酚可抑制內(nèi)源性大麻素降解酶——脂肪酸酰胺水解酶(FAAH),提高內(nèi)源性大麻素水平。本研究擬研究內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在異丙酚預(yù)處理致心臟保護(hù)效應(yīng)中的作用和機(jī)制。第一部分異丙酚對心肌內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的影響目的:內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)包括內(nèi)源性大麻素、大麻素受體(CB1R、CB2R、TRPV1、新型血管型GPCR等)和代謝相關(guān)蛋白和酶類。本研究旨在觀察:(1)異丙酚預(yù)處理能否減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷;(2)異丙酚對基礎(chǔ)條件下和缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞內(nèi)源性大麻素(AEA和2-AG)釋放的影響;(3)異丙酚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后外周血AEA和2-AG水平的影響;(4)異丙酚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞CB1R和CB2R受體表達(dá)影響。方法:實驗一、觀察異丙酚預(yù)處理對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)代謝的影響。采用課題組改良乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法,缺氧12小時/復(fù)氧4小時,建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。實驗分為四組:control(對照組);propofol(單純給予異丙酚孵育);H/R(缺氧/復(fù)氧組);propofol+H/R(異丙酚預(yù)處理組,異丙酚50μM,缺氧前1小時開始孵浴至缺氧結(jié)束)。觀察指標(biāo):細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞儀Annexin V/PI法)、細(xì)胞培養(yǎng)液ECs水平(包括2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol,2-AG)和N-花生四烯酸氨基乙醇(anandamide,AEA),UPLC-MS/MS法測定細(xì)胞培養(yǎng)液2-AG和AEA濃度)、ECs受體CB1R、CB2R mRNA(Real-time PCR)和蛋白質(zhì)水平(Western Blot)情況。實驗二、觀察異丙酚預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷后外周血內(nèi)源性大麻素水平的影響。采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支致心肌缺血再灌注損傷模型。異丙酚預(yù)處理方式為缺血前1小時,首先靜脈注射10mg/kg異丙酚,后39mg/kg·hr靜脈持續(xù)泵注。實驗分sham(假手術(shù)組)、propofol(單純給予異丙酚)、i/r(缺血/再灌注損傷組)和propofol+i/r(異丙酚預(yù)處理組)四組,觀察外周血內(nèi)源性大麻素水平的變化(uplc-ms/ms法)。結(jié)果:實驗一、異丙酚預(yù)處理能夠減少缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞凋亡。缺氧/復(fù)氧后,心肌細(xì)胞釋放aea和2-ag短暫增加。異丙酚預(yù)處理能夠增加細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)源性大麻素水平。缺氧/復(fù)氧可導(dǎo)致心肌細(xì)胞cb1r、cb2rmrna和蛋白質(zhì)水平升高,異丙酚對此無影響。實驗二、異丙酚缺血前預(yù)處理升高大鼠心肌缺血再灌注損傷后外周血aea和2-ag濃度,但維持時間短暫。結(jié)論:異丙酚預(yù)處理能夠減少心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷,并促進(jìn)離體和在體心肌缺氧/缺血后內(nèi)源性大麻素的釋放。第二部分調(diào)控內(nèi)源性大麻素代謝對異丙酚預(yù)處理致心肌細(xì)胞保護(hù)的影響目的:通過給予內(nèi)源性大麻素降解酶faah抑制劑urb597或轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑vdm11提高內(nèi)源性大麻素水平,觀察異丙酚預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)是否依賴于心肌細(xì)胞內(nèi)源性大麻素水平的升高。方法:采用心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,實驗分為八組:control、propofol、h/r、propofol+h/r、faah抑制劑urb597+h/r(單純給予1μmurb597預(yù)處理,缺氧前1.5小時孵育至缺氧結(jié)束)、urb597+propofol+h/r、內(nèi)源性大麻素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑vdm11+h/r(單純給予1μmvdm11預(yù)處理,缺氧前1小時孵育至缺氧結(jié)束);vdm11+propofol+h/r。觀察指標(biāo):細(xì)胞活力(cck法)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞培養(yǎng)液ldh濃度、氧化損傷情況(mda、sod)、活性氧簇ros水平(h2dcfda+流式細(xì)胞儀檢測)、no水平(daf-fmda+流式細(xì)胞儀檢測)。結(jié)果:異丙酚預(yù)處理能夠減輕缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞活力下降和細(xì)胞凋亡,并可減少ldh漏出。較缺氧/復(fù)氧組,異丙酚可降低細(xì)胞mda濃度,升高sod濃度,并降低細(xì)胞ros和no水平。urb597或vdm11預(yù)處理能夠減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。異丙酚和urb597、異丙酚和vdm11在減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷方面不存在協(xié)同作用。結(jié)論:提高內(nèi)源性大麻素水平有助于減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷,異丙酚心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)依賴于內(nèi)源性大麻素的釋放。第三部分異丙酚預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)的大麻素受體機(jī)制目的:通過給予大麻素受體CB1R、CB2R特異性抑制劑,觀察異丙酚心臟保護(hù)效應(yīng)是由哪種受體介導(dǎo)的。方法:采用大鼠結(jié)扎冠狀動脈左前降支致缺血再灌注損傷模型,研究分為七組:sham、I/R(單純?nèi)毖俟嘧p傷組)、propofol+I/R、CB1R拮抗劑AM251+I/R(AM251預(yù)注射組,缺血前1.5小時靜脈注射,1mg/kg)、AM251+propofol+I/R、CB2R拮抗劑AM630(AM630預(yù)注射組,缺血前1.5小時靜脈注射,1mg/kg)、AM630+propofol+I/R。觀察指標(biāo):心肌梗死面積(Evans blue+TTC染色法)、組織病理學(xué)檢查、心肌損傷酶cTn I、氧化損傷指標(biāo)(外周血MPO和SOD)、炎癥損傷指標(biāo)(外周血IL-1β、TNFα、sICAM-1、IL-10)。結(jié)果:異丙酚預(yù)處理可減少心肌梗死面積,降低cTn I水平、降低外周血MPO、IL-1β、TNFα、sICAM-1水平,升高SOD和IL-10濃度。AM251預(yù)處理具有輕微的心肌損傷改善作用,不能對抗異丙酚的心肌保護(hù)效應(yīng)。AM630預(yù)處理加重心肌缺血再灌注損傷,且能夠逆轉(zhuǎn)異丙酚的心肌保護(hù)效應(yīng)。結(jié)論:異丙酚預(yù)處理主要通過大麻素CB2R發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R614

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本文編號：2363814