【摘要】：研究意義 人體骨骼承擔(dān)著機(jī)體運(yùn)動(dòng)、支撐體重和保護(hù)臟器等重要功能,因先天性、外傷、感染、腫瘤等原因造成的骨缺損是臨床常見問題。據(jù)保守估計(jì),美國(guó)每年因骨科疾病導(dǎo)致消耗數(shù)千億美元。我國(guó)每年也有眾多患者需要進(jìn)行骨移植手術(shù),消耗驚人。目前自體骨移植.、異體骨移植和人工合成骨填充材料為常見的骨組織修復(fù)方法,但這些治療方法仍存在很多不足。自體骨移植：供區(qū)疼痛、失血、感染、結(jié)構(gòu)被破壞功能影響、取骨數(shù)量有限；異體骨：免疫排斥反應(yīng),疾病傳染,人工合成骨填充材料目前仍舊只能起到骨缺損填充、支持作用,骨誘導(dǎo)能力較弱。因此,如何更好的修復(fù)骨組織缺損,一直是修復(fù)重建研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 近期,應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)技術(shù)、原理研究開發(fā)替代用組織工程骨為骨缺損的修復(fù)開辟了新途徑、新方法。近年來,關(guān)于骨再生與重建機(jī)制的研究,新型骨移植材料、骨組織工程學(xué)的研究與應(yīng)用,逐漸成為骨科領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究問題之一。體外構(gòu)建與天然骨成分、結(jié)構(gòu)相似的骨生物替代材料,被認(rèn)為是解決上述難題的有效方法之一。磷酸鈣骨水泥(Calcium phosphate cement, CPC)作為一種自固型非陶瓷羥基磷灰石類材料。具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性、生物安全性、能任意塑形、在固化過程中等溫,被認(rèn)為是一種最為理想的骨替代生物材料。然而,骨生物材料的仿生化、功能化和其作用機(jī)制仍遠(yuǎn)未明確。骨生物材料成骨及成血管效果仍有待提高。 目前,骨組織工程已形成了比較豐富的聯(lián)合種子細(xì)胞、生物活性因子及生物材料支架構(gòu)建生物功能化骨生物材料的理論和技術(shù)方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)能在體外增殖維持非分化狀態(tài)并具有分化成：骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基質(zhì)等中胚層組織的潛能,目前已在機(jī)體多個(gè)組織器官中成功提取到具有多分化潛能的MSCs。MSCs具有來源廣泛,取材方便,生長(zhǎng)穩(wěn)定,增殖快,定向分化能力強(qiáng),易于接種成活等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是骨再生修復(fù)中最佳的種子細(xì)胞。在多來源的MSCs中,又以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)研究較多,相關(guān)研究已證實(shí),BMSCs可增強(qiáng)骨生物材料成骨能力,促進(jìn)新生骨生成。此外,各種生物活性因子也被廣泛應(yīng)用于增強(qiáng)骨生物材料的成骨成血管能力,其中富血小板血漿(PRP)作為一種取材方便的血小板濃縮物,激活后可釋放多種生長(zhǎng)因子,在促進(jìn)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化和組織的形成過程中起著重要的作用。自1998年Marx等首次用PRP復(fù)合移植骨修復(fù)下頜骨缺損以來,PRP已逐漸應(yīng)用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域的組織修復(fù)中。 然而,骨組織工程領(lǐng)域?qū)ΨN子細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不明確,PRP對(duì)骨生物材料的成骨成血管效果尚存在爭(zhēng)議。因此,加強(qiáng)骨生物材料的基礎(chǔ)研究,利用仿生技術(shù)聯(lián)合BMSCs和PRP構(gòu)建新型生物功能化骨生物材料,闡明其在體內(nèi)骨組織修復(fù)中的作用效果和作用機(jī)制,證實(shí)CPC不會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及免疫排斥反應(yīng),同時(shí)了解其在體內(nèi)的降解速度、骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)性能,不僅對(duì)提高骨生物材料的認(rèn)識(shí)具有相當(dāng)?shù)目茖W(xué)意義,也可為臨床骨缺損的治療提供全新的治療思路和技術(shù)方法。 研究目的 本研究獲取小型豬骨髓來源BMSCs,進(jìn)行體外擴(kuò)增,通過聯(lián)合CPC與BMSCs共培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)分化,探討CPC對(duì)小型豬BMSCs增殖及成骨分化的影響。此外,CPC聯(lián)合BMSCs和PRP構(gòu)建組織工程骨修復(fù)小型豬股骨髁標(biāo)準(zhǔn)骨缺損,評(píng)價(jià)生物功能化CPC復(fù)合材料在骨組織再生修復(fù)應(yīng)用中的價(jià)值,為骨生物材料的基礎(chǔ)研究,成骨及成血管提供實(shí)驗(yàn)資料和科學(xué)依據(jù)。 研究方法 1)構(gòu)建CPCBMSCs復(fù)合生物材料,評(píng)估CPC對(duì)BMSCs增殖及成骨分化影響 高溫煅燒鈣磷比例約為1：9的磷酸氫鈣和碳酸鈣混合物,按摩爾質(zhì)量比以1：1混合制備CPC粉末并塑型為直徑12mm,厚度1.5mm的薄片支架,采用密度梯度離心法分離并擴(kuò)增BMSCs,將第三代BMSCs與CPC支架于24孔培養(yǎng)板共培養(yǎng),每個(gè)CPC支架種植細(xì)胞數(shù)3*105,添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含100nnM地塞米松,10mMβ-磷酸甘油,0.05mM抗壞血酸和10nM維生素D3)對(duì)BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化21天,對(duì)照組采用同樣方法將BMSCs種植于材料,使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于第1、14、21天采用Live/Dead染色法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性進(jìn)行檢測(cè),評(píng)估成骨組及對(duì)照組BMSCs增殖活力。pNpp定量法對(duì)堿性磷酸酶(ALP)活性進(jìn)行檢測(cè),通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)量其骨鈣素(OC),Ⅰ型骨膠原(C01-Ⅰ),ALP及RUNx-2成骨基因的表達(dá)結(jié)果。同時(shí)采用茜素紅染色法對(duì)在BMSCs材料支架進(jìn)行染色并定量成骨過程形成的礦化物,評(píng)估不同試驗(yàn)組及不同時(shí)間點(diǎn)BMSCs成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果。 2)CPC聯(lián)合BMSCs及PRP構(gòu)建組織工程骨修復(fù)小型豬股骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損 由合作單位馬里蘭大學(xué)提供相同CPC配方制成的直徑7.8mm,高10mm圓柱體孔性CPC支架材料,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雌性小型豬,年齡12-18個(gè)月。每頭動(dòng)物均抽取髂骨骨髓,采用密度梯度離心法分離擴(kuò)增至P2以獲取足量的BMSCs。CPC材料支架經(jīng)嚴(yán)格環(huán)氧乙烷消毒,植入骨缺損前24h進(jìn)行BMSCs種植,將第二代BMSCs消化重懸于成骨誘導(dǎo)液,每個(gè)材料支架滴加100μL含106BMSCs的細(xì)胞懸液,至于孵箱培育,每隔1小時(shí)加入100μL成骨培養(yǎng)基,3小時(shí)后細(xì)胞基本于支架上貼附,加入足量培養(yǎng)基,培養(yǎng)術(shù)前備用。PRP由手術(shù)前即刻準(zhǔn)備,于手術(shù)動(dòng)物前腔靜脈抽取全血10ml,采用200g轉(zhuǎn)速離心20min,提取上清,進(jìn)一步360g轉(zhuǎn)速離心10min,移棄上清液,獲得自體PRP,每200u凝血酶加入0.2mm110%氯化鈣,配成凝血酶激活劑備用。采用速眠新和戊巴比妥鈉聯(lián)合麻醉動(dòng)物,手術(shù)于每頭動(dòng)物雙后肢股骨髁上建立直徑8mm,深度10mm股骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損,第一批6周觀察組6頭動(dòng)物共12個(gè)骨缺損,每4個(gè)隨機(jī)骨缺損分別植入三種不同復(fù)合生物材料:1)CPC;2)CPCBMSCs;3) CPCBMSCsPRP;第二批12周觀察組6頭動(dòng)物共12個(gè)骨缺損,相同方法植入相應(yīng)的組織工程骨。術(shù)后每2周拍攝X線片,觀測(cè)骨缺損生長(zhǎng)情況。分別于6周,12周靜脈注射氯化鉀處死動(dòng)物取標(biāo)本,進(jìn)行MICRO-CT掃描,三維重建,計(jì)算各組剩余材料百分比(RMVF)和新生骨組織體積(MBV)。MICRO-CT掃描后所有標(biāo)本以4%甲醛固定1周,然后樹脂浸泡,乙醇梯度脫水,硬組織切片機(jī)切片,HE染色,觀察各組材料降解、成骨及成血管結(jié)果,采用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算各組新生骨面積百分比(NBA),對(duì)比各組復(fù)合材料骨缺損修復(fù)效果。 研究結(jié)果 live/dead染色結(jié)果顯示對(duì)照組與成骨組CPC表面活細(xì)胞比例及活細(xì)胞密度隨時(shí)間呈上升趨勢(shì),第14天對(duì)照與成骨組活細(xì)胞比例分別升至94.8%和95.2%,對(duì)照組活細(xì)胞密度由第1天為193cells/mm2升至1116cells/mm2'成骨組活細(xì)胞密度由第一天184cells/mm2升至1115cells/mm2,成骨組與對(duì)照組細(xì)胞密度及活細(xì)胞比例對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ALP結(jié)果顯示成骨組中BMSCs中ALP活性第7天時(shí)明顯增高,第14天時(shí)達(dá)峰值為777±48(μMpNPP/min)/(mgProtein),相比第1天ALP活性109±24(μMpNPP/min)/(MgProtein)增高約7倍。而對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)ALP均呈現(xiàn)較低水平表達(dá),最高第4天僅為127±20(μMpNPP/min)/(MgProtein)與成骨組相比,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)成骨組ALP基因表達(dá)第四天達(dá)峰值,約為第1天4倍,第7天稍下降。COL-Ⅰ及OC基因表達(dá)峰值均出現(xiàn)在第7天,分別為第1天表達(dá)量4倍及5倍,而RUNx-2基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在第14天,為第1天表達(dá)量約2倍。對(duì)照組中BMSCs各成骨基因表達(dá)無出現(xiàn)明顯峰值,說明BMSCs在普通培養(yǎng)基條件下不能向成骨細(xì)胞分化。同時(shí)茜素紅染色可見,成骨組在第14天即可觀察到材料表面有礦化鈣鹽組織形成。第21天鈣鹽沉積進(jìn)一步增厚,顏色加深。而對(duì)照組則可觀察到少量著色的細(xì)胞層,沒有明顯的鈣鹽組織生成。成骨組凈生成礦化物由第7天2.32±0.41mM升至第21天5.59±0.2Mm,而對(duì)照組第7、14及21天礦化物生成量分別為0.23±01mM、0.32±0.07mM及0.49±0.08mM,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均相應(yīng)低于成骨組礦化物生成量。 通過聯(lián)合BMSCs和CPC構(gòu)建生物功能化復(fù)合材料,電鏡掃描圖片可以觀察到BMSCs在CPC材料表面貼附生長(zhǎng),細(xì)胞伸展形態(tài)自然,表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)活力。動(dòng)物手術(shù)過程無動(dòng)物出現(xiàn)麻醉死亡,術(shù)后無動(dòng)物出現(xiàn)感染。X線結(jié)果顯示,術(shù)后6周,各組植入材料均與周圍骨組織發(fā)生一定程度的反應(yīng),材料與骨組織交界線逐漸模糊。術(shù)后第12周,材料周圍骨組織進(jìn)一步整合,尤其是CPC-SCP組,材料與周圍骨組織基本融合,交界處模糊不清。分別于兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,每個(gè)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)含4個(gè)標(biāo)本,共獲取標(biāo)本24個(gè)。MICRO-CT結(jié)果顯示,術(shù)后第12周剩余材料體積分?jǐn)?shù)(RMVF) CPC-SCP組為25.45±1.74%,CPC組為38.33±3.49%,CPC-SCP組RMVF明顯低于CPC組,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P0.05).術(shù)后第12周,CPCBMSCsPRP組新生骨體積(NBV)為78.03±3.19mm3而CPC組NBV為53.36±5.36mm3.CPC-SCP組顯著高于CPC組,而CPC-SC組NBV為69.65±1.99mm3,與其余兩組對(duì)比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。硬組織切片HE染色顯示,術(shù)后8周,各組材料均呈現(xiàn)不同程度降解并伴隨新生骨組織長(zhǎng)入。IPP軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示CPC-SCP組術(shù)后8周及術(shù)后12周新生骨面積百分?jǐn)?shù)為16.87±0.66%及25.99±3.12%,均明顯高于CPC組新生骨面積分?jǐn)?shù)(P0.05)。而CPC-SCP組新生骨百分?jǐn)?shù)與CPC-SC組相比較,無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 新型磷酸鈣骨水泥具有良好的生物相容性,小型豬BMSCs在CPC表面具有較旺盛的增殖活力,并且可以獲得良好成骨誘導(dǎo)效果,進(jìn)一步的體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)表明,新型CPC聯(lián)合BMSCs和PRP構(gòu)建生物活性化組織工程骨對(duì)小型豬股骨髁標(biāo)準(zhǔn)骨缺損修復(fù)效果比較滿意,CPC材料在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物相容性,降解性能及骨傳導(dǎo)性能,復(fù)合BMSCs及PRP則可進(jìn)一步加快了材料的降解,提高骨缺損修復(fù)療效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R687
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本文編號(hào)：2359040