【摘要】：背景創(chuàng)傷性脊髓損傷(spinal cold injury, SCI)是一種高致殘性的疾病,常導(dǎo)致SCI患者損傷平面以下肢體的感覺和運動功能障礙,嚴(yán)重影響患者后期的生活質(zhì)量。當(dāng)前不論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家,SCI的發(fā)病率仍較高,并且總發(fā)病人數(shù)逐年上升,給患者家庭和全社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。SCI的病理生理機制十分復(fù)雜,包括原發(fā)性害和繼發(fā)性損害兩個階段。原發(fā)性損傷階段主要是由物理打擊直接造成脊髓組織的機械性破壞,以損傷部位為中心出血、缺血及壞死等為特征；繼發(fā)性損傷是由原發(fā)性損傷序貫性激活局部和全身的炎癥反應(yīng)及損傷后的適應(yīng)性改變等引起的細胞死亡或退變。繼發(fā)性損傷在創(chuàng)傷后短時間內(nèi)啟動,并且持續(xù)時間長,可以造成更多的神經(jīng)元退變或死亡,對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷不亞于原發(fā)性損傷。因此,如何阻止或減輕繼發(fā)性損害對神經(jīng)系統(tǒng)的影響是SCI治療的重心和研究切入點。然而盡管對于SCI的治療人們做了大量的研究工作,但是目前仍然沒有取得實質(zhì)性的進展。我們發(fā)現(xiàn)既往研究主要集中在采取措施促進損傷部位脊髓的再生,沒有過多的關(guān)注與脊髓緊密相連的大腦在SCI后有何變化,而我們此前的研究發(fā)現(xiàn)SCI后大腦部分區(qū)域出現(xiàn)了萎縮,以初級運動皮層萎縮最為明顯,并且與患者的功能恢復(fù)有密切關(guān)系；另外已經(jīng)證實SCI后大腦運動皮層細胞可以出現(xiàn)凋亡。因此我們推測大腦運動皮層的萎縮可能對SCI患者的功能恢復(fù)產(chǎn)生阻礙作用,而凋亡可能是引起大腦運動皮層萎縮的重要原因。因為假設(shè)位于大腦運動中樞的胞體已經(jīng)發(fā)生了結(jié)構(gòu)和功能改變,再生或修復(fù)的軸突不能與大腦相應(yīng)中樞形成有效的突觸連接,即使脊髓斷端軸突完全再生也很難達到肢體功能完全恢復(fù)的目的。但是目前關(guān)于SCI后大腦運動皮層萎縮及細胞的凋亡機制尚未明確。既往的研究證實神經(jīng)元的凋亡有兩種方式,即caspase依賴性的凋亡途徑和caspase非依賴性途徑。其中在caspase依賴性途徑中起關(guān)鍵作用的酶是cleaved caspase-3,其被激活后使細胞最終走向凋亡；而caspase非依賴性途徑主要是由凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor, AIF)介導(dǎo)。AIF是存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的一種黃素蛋白,同時具有氧化還原酶活性和凋亡誘導(dǎo)活性的雙重功能,但兩種功能間是脫偶聯(lián)的。當(dāng)AIF被水解激活后可迅速進入細胞質(zhì),可以與細胞核結(jié)合使染色質(zhì)凝集、將DNA水解為小片段,促進細胞凋亡。線粒體功能障礙是引起AIF水解的重要因素。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白,正常情況下與微管結(jié)合,但在被糖元合成酶激酶3β(glycogen synthasekinase-3β, GSK-3β)催化發(fā)生磷酸化后可以從微管脫落,引起微管穩(wěn)定性下降或解聚。Tau蛋白磷酸化和去磷酸化之間的平衡是維持神經(jīng)元微管穩(wěn)定性、保證細胞完成線粒體等細胞器在軸漿中正常運輸?shù)那疤帷Ｔ趧?chuàng)傷性腦損傷的研究中發(fā)現(xiàn)tau蛋白過度磷酸化可以引起微管解聚、線粒體分布異常和線粒體功能障礙,最終導(dǎo)致了神經(jīng)元退變或凋亡。但是關(guān)于脊髓損傷后大腦運動皮層是否出現(xiàn)tau蛋白過度磷酸化及其與大腦運動皮層神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系,目前尚無相關(guān)報道。因此深入了解SCI后大腦運動皮層神經(jīng)元的凋亡機制,對完善SCI的病理生理機制、制定綜合治療措施具有重要意義。目的本研究擬通過結(jié)合不同的方法檢測不同傷程度的SCI大鼠大腦運動皮層細胞的凋亡情況、磷酸化的tau蛋白(phosphorylated tau, p-tau)及與凋亡途徑中重要的蛋白(cleaved caspase-3和AIF)的動態(tài)表達變化,以明確大腦運動皮層神經(jīng)元的凋亡方式,并探究tau蛋白過度磷酸化在啟動凋亡中的作用；另外早期應(yīng)用LiCl抑制tau蛋白磷酸化,觀察大腦運動皮層細胞的凋亡變化和運動功能的變化情況,最終初步闡明SCI后大腦運動皮層神經(jīng)元發(fā)生凋亡的機制,為SCI的治療提供新的理論基礎(chǔ)和實驗基礎(chǔ)。方法本研究包括兩個實驗階段：1、在第一個實驗階段,120只平均體重為230g左右的SD (Sprague-dawley)雌性大鼠隨機分為Sham組、輕度SCI組、中度SCI組和重度SCI組。Sham組只去除T8的椎板、暴露硬膜即可,不損傷脊髓；SCI組大鼠在顯露T8脊髓硬膜后,在NYU-MASCIS脊髓損傷系統(tǒng)中用l0g的金屬桿分別自125mm、250mm、500mm的高度自由下落打擊T8節(jié)段脊髓背側(cè)正中,即輕度SCI組、中度SCI組和重度SCI組脊髓受到打擊能量分別為125g×mm、250g ×mm和500g×mm,制作不同損傷程度的SCI模型。在損傷后1d、3d、7d、14d和28d分別對大鼠進行BBB評分,再采用10%水合氯醛過量麻醉法處死大鼠,根據(jù)檢測要求的不同取大鼠的損傷段脊髓和大腦運動皮層(M1區(qū))組織于不同條件下保存待測。主要的檢測方法和指標(biāo)有：(1)脊髓組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,觀察造模后脊髓組織結(jié)構(gòu)的損傷情況；采用TUNEL染色觀察大腦運動皮層細胞的凋亡情況,并計數(shù)TUNEL染色陽性的細胞核,計算凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI); (2) Western blot檢測大腦運動皮層的caspase-3、AIF和tau蛋白的表達變化,采用Image Pro Plus 6.0測定灰度值,計算各時間點各蛋白的相對量并比較各組間的差異性；(3)采用免疫熒光染色標(biāo)記AIF和p-tau共定位情況,同時計算AIF和p-tau雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元計數(shù),并比較各組間的差異。(4)采用相關(guān)性分析,計算上述檢測指標(biāo)的相關(guān)性。2、在第二階段實驗中,30只10±2W齡、平均體重約230g的SD(Sprague-dawley)雌性大鼠隨機分為sham組、SCI+LiCl組和SCI+NaCl組。Sham組造模時只去除T8的椎板、暴露硬膜,不損傷脊髓；將SCI組大鼠固定于NYU-MASCIS打擊器上,用250g×mm的打擊能量打擊T8節(jié)段脊髓,損傷后SCI+LiCl組大鼠立即予以20mg/kg. b. w的劑量的LiCl溶液腹腔注射,SCI+NaCl組則腹腔注射相同比例體積的生理鹽水,此后每日注射1次,連續(xù)應(yīng)用3天。觀察指標(biāo)和方法：(1)在損傷后1W時每組取6只大鼠取大鼠大腦運動皮層組織,采用TUNEL染色法觀察各組大腦運動皮層神經(jīng)元的凋亡情況,采用Western blot檢測p-tau和AIF的表達情況；(2)在1W、2W、3W和4W對大鼠進行BBB評分,觀察后肢運動功能變化。結(jié)果第一階段的實驗結(jié)果：(1)SCI后1d大鼠脊髓損傷段HE染色結(jié)果顯示不同損傷程度的大鼠脊髓組織的破壞程度不同,提示成功制作了不同損傷程度的大鼠模型；(2)SCI大鼠大腦皮層早期即可出現(xiàn)細胞的凋亡,并且在損傷后第7天凋亡指數(shù)達到峰值,損傷越重AI越大,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,7d的AI與28d大鼠的BBB評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=0.873,P0.05),7d以后雖有減輕,但仍維持在較高水平。(3)大腦運動皮層p-tau與AIF的表達存在時空變化關(guān)系。大腦運動皮層M1區(qū)Western blot結(jié)果顯示sham組的cleaved caspase-3、AIF和p-tau在觀察期內(nèi)表達無明顯變化；Mod SCI組和Sev SCI組的cleaved caspase-3僅在7d、14d及28d時有輕度上升,但是與Sham組和Mil SCI組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而caspase非依賴性途徑中起關(guān)鍵作用的AIF的表達在SCI后顯著上升,在7d時達到峰值,此后表達有所降低,但SCI組的AIF仍顯著高于Sham組,在相同的時間點損傷程度越重AIF的表達越高,組間相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05); p-tau在SCI后早期也顯著升高,峰值的的出現(xiàn)時間與AIF一致,相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者的表達具有正相關(guān)關(guān)系(r=0.827,P0.01)；免疫熒光的結(jié)果證實了p-tau與AIF有共定位關(guān)系,同時7d時的p-tau與AIF共定位陽性細胞計數(shù)達到最大值,與28d時BBB評分呈正相關(guān)關(guān)系(r=-0.852,P0.01)。第二階段的實驗結(jié)果：(1)抑制tau蛋白磷酸化,可顯著降低SCI大鼠大腦運動皮層細胞的凋亡。7d時SCT+LiCl組大腦運動皮層p-tau和AIF與SCI+NaCl組相比均顯著下降(P0.05),并伴隨著凋亡指數(shù)的下降(P0.05)；(2)抑制tau過度蛋白磷酸化可促進SCI大鼠運動功能的恢復(fù)：與SCl+NaCl相比,SCI+LiCl組從2周起B(yǎng)BB評分有明顯提高,在3W和4W時兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.脊髓損傷后大腦運動皮層在早期便可發(fā)生細胞凋亡,與脊髓損傷程度有相關(guān)性,損傷越重引起大腦皮層凋亡的細胞越多；脊髓損傷后大腦運動皮層持續(xù)性的細胞凋亡可能是引起大腦運動皮層萎縮的重要原因。2.脊髓損傷后大腦運動皮層細胞的凋亡方式可能主要由AIF介導(dǎo)的非caspase依賴性途徑；脊髓損傷后大腦運動皮層tau蛋白過度磷酸化可能在AIF的激活過程中起了重要作用。3.抑制tau蛋白過度磷酸化可以減輕脊髓損傷后大鼠大腦運動皮層細胞的凋亡,并且在一定程度上促進大鼠運動功能的恢復(fù),因此如何精確地減輕脊髓損傷后大腦運動皮層tau蛋白過度磷酸化可能是脊髓損傷治療的一個新靶點,但是需要深入研究脊髓損傷后大腦運動皮層tau蛋白過度磷酸化在啟動細胞凋亡的具體機制,以爭取早期、精確、有效的采取干預(yù)措施,最大限度恢復(fù)脊髓損傷患者的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2

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本文編號：2357262