【摘要】：前言 局部麻醉藥是臨床廣泛應(yīng)用的麻醉藥物,使用局部麻醉藥進(jìn)行神經(jīng)阻滯對(duì)于手術(shù)中或手術(shù)后疼痛的控制具有重要作用。與全身麻醉和靜脈使用阿片類鎮(zhèn)痛藥物相比,神經(jīng)阻滯麻醉對(duì)患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境干擾小,并且能更好的緩解疼痛,有利于患者身體功能早期恢復(fù),因而更加受到麻醉醫(yī)師的歡迎。然而,使用局部麻醉藥物進(jìn)行神經(jīng)阻滯可能造成神經(jīng)毒性甚至導(dǎo)致術(shù)后神經(jīng)并發(fā)癥。因此,大部分患者應(yīng)用局部麻醉藥只是短期應(yīng)用。盡管如此,應(yīng)用局部麻醉藥進(jìn)行神經(jīng)阻滯仍然可能造成永久性神經(jīng)損傷,在有些病例甚至?xí)斐捎谰眯匝静可窠?jīng)病變和馬尾神經(jīng)綜合征。大約1/3的患者經(jīng)歷過短暫的神經(jīng)癥狀,持續(xù)性腰骶部神經(jīng)病變的發(fā)生率大約為1/200到1/3000,另外在局部麻醉后誘發(fā)了馬尾神經(jīng)綜合征的患者大概為1/1000到1/10000。臨床常用局部麻醉藥布比卡因是一種鈉通道阻滯劑,一直被廣泛的應(yīng)用于局部神經(jīng)浸潤麻醉、硬膜外麻醉和鞘內(nèi)麻醉。然而,布比卡因具有神經(jīng)毒性作用能夠造成神經(jīng)損傷。因此,深入研究局部麻醉藥物的神經(jīng)損傷機(jī)制,研發(fā)降低神經(jīng)損傷風(fēng)險(xiǎn)的新措施是非常必要的。 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,以異源三聚體的形式存在,它含有一個(gè)起催化作用的α亞基和兩個(gè)起調(diào)節(jié)作用的p和γ亞基,當(dāng)調(diào)節(jié)亞基β和γ亞基與α亞基結(jié)合后,此酶的活性大大提高。大量證據(jù)表明,AMPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量狀態(tài)以及控制細(xì)胞代謝水平中都發(fā)揮著重要的作用。最近有研究表明AMPK與神經(jīng)元的生存和死亡密切相關(guān)。Kim研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了AMPK對(duì)布比卡因處理過的施萬細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)作用。由于局部麻醉藥物的神經(jīng)毒性作用是神經(jīng)損傷的主要原因之一,因此AMPK信號(hào)分子可能參與了局部麻醉藥物的神經(jīng)損傷機(jī)制。 高車前素(Hispidulin)是一種天然的黃酮類化合物,可以從天山雪蓮等中草藥中提取獲得。以往體內(nèi)體外研究提示高車前素具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌以及抗炎和抗誘變等很多的性能。另有研究證明,高車前素可以作為正性變構(gòu)分子作用于苯二氮卓類受體。最近一項(xiàng)研究表明高車前素可以抑制大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸的釋放。高車前素還被證實(shí)可以通過血腦屏障并具有抗癲癇的作用�？傊�,這些研究提示高車前素可以作為神經(jīng)元細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑。此外,高車前素可以通過AMPK信號(hào)通路抑制人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。因此,高車前素可能通過AMPK通路減弱局部麻醉藥物導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。為證明該假設(shè),本研究擬應(yīng)用高車前素作用于布比卡因處理的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞,采用檢測(cè)細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位變化等方法來分析高車前素和布比卡因?qū)2a細(xì)胞活力的影響。在此基礎(chǔ)上,再應(yīng)用AMPK信號(hào)通路特異性抑制劑研究高車前素和布比卡因?qū)е录?xì)胞活力改變的具體機(jī)制。研究方法1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞從日本東京醫(yī)學(xué)研究所獲得。N2a細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和100μg/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞放在37℃恒溫濕潤并含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞融合達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在制作實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞懸液前將N2a細(xì)胞消化處理并培養(yǎng)過夜。2MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 采用MTT法測(cè)定N2a細(xì)胞活力,簡(jiǎn)言之,N2a細(xì)胞在含有或者不含有高車前素的不同濃度布比卡因中分別進(jìn)行處理12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)。將細(xì)胞進(jìn)一步以0.5mg/ml MTT試劑在37℃條件下孵育4小時(shí),然后加入DMSO溶解甲佨結(jié)晶,并在酶標(biāo)儀上測(cè)量其在570nm處的吸光度數(shù)值。3細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用FITC標(biāo)記的Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,對(duì)凋亡的N2a細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)言之,N2a細(xì)胞用冰冷的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行漂洗,并重懸于結(jié)合緩沖液中,細(xì)胞濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml。在暗室中將細(xì)胞用Annexin V-FITC和Propidium (PI)染色,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。Annexin V-FITC陽性和PI-陰性細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。 4線粒體膜電位的測(cè)定 采用JC-1染料評(píng)估N2a細(xì)胞處理前后線粒體膜電位的變化。JC-1染料是線粒體特異的親脂性陽離子熒光染料,正常條件下JC-1聚集在線粒體內(nèi)并發(fā)射紅色熒光。然而,當(dāng)細(xì)胞凋亡過程中線粒體膜電位被打亂,JC-1染料會(huì)發(fā)出綠色熒光。因此,紅色與綠色的JC-1熒光的比值被用作評(píng)估線粒體膜電位變化的標(biāo)記。N2a細(xì)胞用布比卡因處理12小時(shí)后,加入100μl的JC-1溶液并將細(xì)胞與JC-1繼續(xù)孵育1小時(shí),然后用PBS洗滌兩次,再在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 5免疫蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 制備用于免疫印跡分析的N2a細(xì)胞。取50μg溶胞產(chǎn)物在12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,并轉(zhuǎn)印。將膜孵育特定的一抗：AMPK, p-AMPK, GSK3β, p-GSK3β和Caspase-3,然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗進(jìn)行孵育。免疫反應(yīng)條帶采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯色。結(jié)果通過密度計(jì)掃描進(jìn)行定量。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示；兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行評(píng)價(jià)。多重比較采用Tukey's檢驗(yàn)。P0.05被定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果 1布比卡因使N2a細(xì)胞的存活率降低 用布比卡因在不同濃度不同時(shí)間處理N2a細(xì)胞。結(jié)果表明,布比卡因降低N2a細(xì)胞的存活率,其作用呈時(shí)間劑量依賴性。細(xì)胞凋亡率隨布比卡因的濃度增加而增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示用400μM布比卡因作用12小時(shí)不會(huì)明顯降低細(xì)胞存活率或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而,N2a細(xì)胞與1200μM布比卡因共孵育36小時(shí)可以殺死全部細(xì)胞。在本研究中,我們選擇800μM的布比卡因濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度,來探討高車前素是否對(duì)布比卡因造成的N2a細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。 2高車前素逆轉(zhuǎn)布比卡因造成的N2a細(xì)胞的損傷作用 本研究檢測(cè)了高車前素對(duì)布比卡因造成的細(xì)胞損傷的影響。40μM或更高濃度(如60μM、80μM)的高車前素可以逆轉(zhuǎn)布比卡因造成的細(xì)胞存活率的降低。由于不同濃度的高車前素對(duì)N2a細(xì)胞的保護(hù)作用未見明顯差異,我們選擇40μM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。本實(shí)驗(yàn)中使用布比卡因處理N2a細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)可以降低細(xì)胞存活率分別為42.4%,52.4%和74.9%(P0.05)。雖然高車前素單獨(dú)處理對(duì)N2a細(xì)胞的存活率無明顯影響,但高車前素可以明顯逆轉(zhuǎn)布比卡因誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞的損傷。與對(duì)照組相比,在布比卡因作用N2a細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)后,高車前素可以明顯提高N2a細(xì)胞的存活率,分別提高26%、38.5%和47.5%(P0.05)。 3高車前素逆轉(zhuǎn)布比卡因?qū)2a細(xì)胞的凋亡作用 我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)高車前素是否能夠逆轉(zhuǎn)布比卡因誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。當(dāng)將布比卡因與N2a細(xì)胞共孵育24小時(shí),細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組增加了8.5倍(P0.01)。然而,如果用高車前素預(yù)處理細(xì)胞,布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被抑制了73.6%,和對(duì)照組相比有明顯差異(P0.01)。然后,我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)(36小時(shí)和48小時(shí))檢測(cè)高車前素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,以驗(yàn)證高車前素的保護(hù)作用不是由于延緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生。布比卡因作用36小時(shí)和48小時(shí)后細(xì)胞的凋亡率分別增加83%和140%(P0.05)。高車前素處理可以明顯減少36小時(shí)和48小時(shí)布比卡因造成的細(xì)胞凋亡率,分別減少53.6%和54%(P0.01) 4高車前素抑制布比卡因誘導(dǎo)的線粒體膜電位損傷和Caspase-3的裂解 既往研究提示布比卡因可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Capase-3的裂解在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用,因此,我們檢測(cè)了線粒體膜電位和Caspase-3的變化。結(jié)果顯示,布比卡因可以明顯降低N2a細(xì)胞的線粒體膜電位(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明高車前素可以明顯降低布比卡因造成的線粒體膜電位損傷。接下來,我們檢測(cè)了線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物即裂解的Caspase-3。布比卡因可以明顯的增加N2a細(xì)胞中Caspase-3的水平,這進(jìn)一步表明布比卡因是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。然而,高車前素可以抑制裂解的Caspase-3的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明高車前素抑制布比卡因造成的細(xì)胞凋亡是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。 5高車前素抑制布比卡因誘導(dǎo)的AMPK的失活 最近研究提示AMPK信號(hào)通路參與了神經(jīng)元細(xì)胞的存活狀態(tài)的調(diào)節(jié)。我們檢測(cè)了AMPK是否在高車前素抑制布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮作用。結(jié)果表明布比卡因可以降低AMPK和GSK3P的磷酸化水平,而高車前素可以明顯逆轉(zhuǎn)此過程。 6AMPK抑制劑消除了高車前素所致的AMPK和GSK3β的磷酸化水平的增加 復(fù)合物C是AMPK的特異性抑制劑。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合物C來檢測(cè)AMPK通路是否介導(dǎo)了高車前素的抗布比卡因細(xì)胞損傷作用。結(jié)果表明相對(duì)于未經(jīng)復(fù)合物C處理的細(xì)胞,在使用復(fù)合物C處理后各組細(xì)胞的AMPK和GSK3β的磷酸化水平均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 7AMPK抑制劑降低了高車前素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)細(xì)胞活力下降的保護(hù)作用 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)合物C單獨(dú)作用并不能明顯的改變高車前素對(duì)細(xì)胞存活率的影響。然而,復(fù)合物C可以加劇布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞損傷。而且復(fù)合物C預(yù)處理細(xì)胞后,高車前素對(duì)N2a細(xì)胞的保護(hù)性作用降低,和未使用復(fù)合物C處理組相比,N2a細(xì)胞的存活率降低了31.8%(P0.05)。這些結(jié)果提示抑制AMPK通路可以明顯降低高車前素對(duì)布比卡因造成的N2a細(xì)胞損傷的保護(hù)性作用。 8AMPK抑制劑減弱了高車前素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)性作用 在布比卡因處理組,使用AMPK抑制劑預(yù)處理N2a細(xì)胞可以增加細(xì)胞9.1%的凋亡率,而在布比卡因和高車前素共同作用組,使用AMPK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率增加了397.8%�？梢�,使用AMPK特異性抑制劑復(fù)合物C處理后,高車前素對(duì)布比卡因造成細(xì)胞凋亡的抑制性作用明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 9AMPK抑制劑減弱高車前素的細(xì)胞保護(hù)作用是通過加劇線粒體功能異常實(shí)現(xiàn)的 與對(duì)照組相比,在布比卡因組,使用AMPK特異性的抑制劑復(fù)合物C預(yù)處理可以降低12.9%的線粒體膜電位,而在高車前素和布比卡因聯(lián)合作用組,復(fù)合物C可以降低31.8%的線粒體膜電位。另外,在布比卡因組和布比卡因與高車前素聯(lián)合處理組,復(fù)合物C處理可以明顯增加裂解的Capase-3表達(dá)水平。這些結(jié)果表明AMPK抑制劑可以減弱高車前素對(duì)布比卡因?qū)е碌募?xì)胞凋亡的保護(hù)作用,該作用通過加劇線粒體功能異常來實(shí)現(xiàn)。 研究結(jié)論 本研究在小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞中,探討了高車前素對(duì)布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)毒性損傷的影響及其相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,布比卡因使N2a細(xì)胞的存活率降低。高車前素可以逆轉(zhuǎn)布比卡因造成的N2a細(xì)胞的損傷作用,并可減少布比卡因?qū)е碌腘2a細(xì)胞凋亡。高車前素的上述作用與其抑制布比卡因誘導(dǎo)的線粒體膜電位損傷和Caspase-3的裂解有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究提示,高車前素可以抑制布比卡因誘導(dǎo)的AMPK的失活,應(yīng)用AMPK特異性抑制劑消除了高車前素所致的AMPK和GSK3β的磷酸化水平的增加,同時(shí)AMPK抑制劑也降低了高車前素對(duì)布比卡因所致的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,減弱了高車前素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)性作用。AMPK抑制劑減弱高車前素的細(xì)胞保護(hù)作用是通過加劇線粒體功能異常實(shí)現(xiàn)的�？傊�,本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了高車前素可以減弱布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷作用,這種作用至少部分是通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中獲得的,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否成立仍需要進(jìn)一步研究,這些結(jié)果提示高車前素對(duì)布比卡因所致神經(jīng)毒性具有治療作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R614

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本文編號(hào)：2333987