【摘要】：目的:腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因,因此CSCs成為腫瘤治療的主要靶細(xì)胞。膠質(zhì)瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)是惡性程度很高的腦腫瘤,具有死亡率高、生存期短的特點(diǎn)。植物藥在腫瘤治療研究中占有非常重要的地位,非洲天門冬屬于非洲藤本、蔓生植物,生長于熱帶或氣候溫和地區(qū),廣泛分布于我國各地,資源豐富。課題組在對植物藥提取成分進(jìn)行抗腫瘤活性物大通量篩選后,發(fā)現(xiàn)非洲天門冬提取物WADM-3可靶向殺傷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(Glioma Stem Cells,GSCs)。本研究對WADM-3殺傷GSCs的作用進(jìn)行研究,在細(xì)胞水平上探討其殺傷GSCs可能機(jī)制;動(dòng)物模型是篩選新藥的基礎(chǔ),同時(shí)我們成功建立膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)原位移植瘤小鼠模型,為發(fā)現(xiàn)靶向GSCs天然活性藥物提供理論基礎(chǔ)。方法:1.天然提取物中抗腫瘤成分的篩選對獲得的植物組分進(jìn)行篩選�；贕SCs篩選,同時(shí)將活性組分作用于NSCs、膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG。消化GSCs-3#體外培養(yǎng)細(xì)胞后制備成單細(xì)胞懸液,接種在laminin包被的96孔板上20000cells/孔,培養(yǎng)24h后加入10ug/ml濃度WADM-3,分別于作用后24h、48h、72h觀察細(xì)胞狀態(tài)。2.非洲天門冬提取物對GSCs的殺傷作用2.1非洲天門冬提取物對GSCs及NSCs細(xì)胞毒性測試采用GSCs和正常NSCs同時(shí)進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測試以證實(shí)提取物抗腫瘤作用。將GSCs和NSCs鋪至24孔培養(yǎng)板(20000cells/孔)。24小時(shí)后將10ug/ml濃度的非洲天門冬提取物作用于細(xì)胞,分別于作用后24h、48h、72h觀察細(xì)胞狀態(tài)。通過評價(jià)非洲天門冬提取物對GSCs和NSCs產(chǎn)生的不同毒性作用,明確其對GSCs具有的靶向殺傷作用,并探討其產(chǎn)生的可能機(jī)制。2.2非洲天門冬提取物對GSCs的IC50的測定細(xì)胞消化后將細(xì)胞接種在在96孔板上(20000cells/孔),培養(yǎng)24h后添加非洲天門冬提取物。提取物按終濃度20mg/ml,2倍梯度濃度進(jìn)行稀釋,與培養(yǎng)基混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)72h后,吸去培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基,將MTS按1:10比例與培養(yǎng)基混勻后,加入100ml/孔到培養(yǎng)板上,培養(yǎng)1h后,利用酶標(biāo)儀測量其在490nm處吸光值,計(jì)算IC50值。2.3非洲天門冬提取物對GSCs克隆形成能力(Colony efficiency,CE)的測試GSCs與軟瓊脂混勻后平鋪在6孔板內(nèi)(30000cells/孔),放置培養(yǎng)箱培養(yǎng),每隔5天更換一次培養(yǎng)基,待克隆形成后將非洲天門冬提取物按照10ug/ml濃度加到孔板上,對照組加同樣濃度的二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO),10天后,用含有0.05%結(jié)晶紫的多聚甲醛固定細(xì)胞,計(jì)數(shù)克隆數(shù)。觀察非洲天門冬提取物過GSCs體外克隆形成能力的影響,評價(jià)提取物對GSCs的抑制及殺傷作用。3.非洲天門冬提取物對GSCs殺傷作用的機(jī)制研究3.1非洲天門冬提取物對GSCs細(xì)胞增殖的作用檢測GSCs細(xì)胞消化后以6×104密度鋪24孔板。48小時(shí)后,加入5mg/ml終濃度的提取物進(jìn)行處理。培養(yǎng)24h后細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞毒表型,進(jìn)行Brd U抗體染色,利用免疫熒光技術(shù)追蹤增殖的細(xì)胞。同時(shí)利用DAPI對正常細(xì)胞進(jìn)行染色。經(jīng)雙重染色對比后觀察細(xì)胞增殖情況。通過對細(xì)胞增殖檢測結(jié)果評價(jià)提取物靶向殺傷GSCs的作用是否通過抑制細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn),探討其殺傷GSCs的作用機(jī)制。3.2非洲天門冬提取物對GSCs凋亡的作用檢測GSCs細(xì)胞消化后以6×104密度鋪24孔板。48小時(shí)后,加入5mg/ml終濃度的提取物進(jìn)行處理。培養(yǎng)24h后細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞毒表型,進(jìn)行Caspase-3抗體染色,利用免疫熒光技術(shù)追蹤凋亡的細(xì)胞。同時(shí)利用DAPI對正常細(xì)胞進(jìn)行染色。經(jīng)雙重染色對比后觀察細(xì)胞凋亡情況。通過對細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果評價(jià)提取物殺傷GSCs的作用是否通過誘導(dǎo)其凋亡而產(chǎn)生,探討其殺傷GSCs的作用機(jī)制。3.3非洲天門冬提取物對細(xì)胞周期的影響將非洲天門冬提取物作用于GSCs,培養(yǎng)48H后,PI染色后通過流式細(xì)胞技術(shù)(Flow Cytometry,FCM)分析非洲天門冬提取物作用于GSCs對細(xì)胞周期分布的影響,探討提取物對GSCs殺傷的作用機(jī)制。4.GBM原位移植瘤小鼠模型的建立4.1 GSCs的體外貼壁培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所用GSCs為本課題組前期從臨床腫瘤中分離出來的。采用貼壁培養(yǎng)方式體外培養(yǎng)培養(yǎng)GSCs,為在整體及細(xì)胞水平上研究非洲天門冬提取物抗腫瘤效果提供基礎(chǔ)。4.2小鼠的GBM原位移植瘤模型的建立采用非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠。小鼠麻醉后暴露頭骨并將小鼠固定在腦立體定位儀上。頭骨“十”字線向上1mm,向左2mm,即腦左側(cè)紋狀體部位進(jìn)行鉆孔,進(jìn)針深度3mm,以0.2ul/min速度將2ul,30000個(gè)細(xì)胞懸液注入腦部。微量注射器顯示注射完畢后,縫合小鼠并術(shù)后觀察。4.3 GBM原位移植瘤小鼠模型瘤體組織的病理檢查對GBM原位移植瘤小鼠模型腦部的病理組織進(jìn)行HE染色以及組織化學(xué)免疫染色。組織蠟塊用蘇木素-伊紅進(jìn)行染色,對切片病理進(jìn)行組織出血、壞死、浸潤性生長觀察。Ki67是標(biāo)記細(xì)胞增殖抗原,Ki67抗體對模型腦部的病理組織進(jìn)行組織化學(xué)免疫染色,同時(shí)加入DAPI染色正常細(xì)胞,雙重染色后觀察瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖情況。結(jié)果:1.天然提取物中抗腫瘤成分的篩選52個(gè)天然提取物成分進(jìn)行篩選,10個(gè)成分顯示無效為假陽性活性物,對GSCs有細(xì)胞毒性的成分為42個(gè);在42個(gè)復(fù)篩有效成分中僅有3個(gè)成分對NSC沒有細(xì)胞毒性;在對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、U-87MG的篩選結(jié)果中顯示42個(gè)有效成分中僅有3個(gè)成分對T98G、U-87MG有細(xì)胞毒性。2.非洲天門冬提取物對GSCs的殺傷作用2.1藥物處理后形態(tài)學(xué)觀察加入藥物后,對培養(yǎng)板內(nèi)GSCs與NSCs進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和比較,非洲天門冬提取物對GSCs有明顯的細(xì)胞毒性而對NSCs幾乎沒有損傷。2.2 IC50檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),提取物對GSCs IC50的濃度為2.2-2.8ug/ml,遠(yuǎn)小于對于正常的NSCs IC50濃度(40ug/ml),表明非洲天門冬提取物對GSCs細(xì)胞具有靶向性的殺傷作用。2.3非洲天門冬提取物能破壞GSCs的克隆形成能力體外形成克隆實(shí)驗(yàn)表明非洲天門冬提取物不僅抑制克隆的繼續(xù)生長,而且還將已形成的克隆殺死,最后導(dǎo)致克隆的破碎、死亡,而對照組添加溶劑DMSO對GSCs的克隆形成沒有影響。3.非洲天門冬提取物對GSCs特異性殺傷作用機(jī)制探討3.1利用Brdu抗體染色法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測結(jié)果表明非洲天門冬提取物對GSCs的增殖沒有明顯抑制作用(P=0.32),處理組的細(xì)胞的增殖比率(Growth Fraction,GF)為28.5%,對照處理組細(xì)胞的增殖比率為27.1%。3.2利用Caspase-3途徑檢測非洲天門冬提取物對GSCs凋亡結(jié)果表明活性成分顯著誘導(dǎo)GSCs凋亡(P=0.0002)。非洲天門冬提取物處理組細(xì)胞凋亡率為20%,對照處理組的細(xì)胞凋亡率為5.1%,提示非洲天門冬提取物對GSCs的殺傷作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而非抑制細(xì)胞增殖來實(shí)現(xiàn)的。3.3細(xì)胞周期檢測非洲天門冬提取物作用GSCs 72小時(shí)后,細(xì)胞生長周期分布影響的實(shí)驗(yàn)表明提取物對細(xì)胞周期影響不大(P=0.48)。4.小鼠GBM模型的建立與評價(jià)小鼠注射后4周在注射部位發(fā)生明顯腫瘤。通過病理切片的結(jié)果表明,GBM病理特征明顯,提示小鼠GBM模型建立成功,可用于非洲天門冬活性物質(zhì)對體內(nèi)抗腫瘤的效果研究。結(jié)論:1.篩選出3個(gè)選擇性殺傷GSCs有效成分,其中WADM-3為單體。2.WADM-3對GSCs具有靶向殺傷作用。3.WADM-3顯著誘導(dǎo)GSCs凋亡,但并不明顯抑制GSCs的增殖。4.建立的GBM原位移植瘤小鼠模型與臨床病理特征類似,可用于GBM研究。
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【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5

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1 嚴(yán)蘭珍;非洲天門冬提取物WADM-3對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞殺傷作用的研究[D];云南中醫(yī)學(xué)院;2016年

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本文編號：2332312