【摘要】：目的：本課題是在課題組既往研究已證實原位移植兔外周血間充質(zhì)干細胞(PBMSCs)對于液氮冷凍兔股骨頭壞死模型具有治療效應的基礎上，進一步提供移植PBMSCs的體內(nèi)定植與存活情況以及移植后股骨頭病損區(qū)域以細胞因子為主的內(nèi)環(huán)境改變情況，為闡明PBMSCs移植治療股骨頭壞死的可能機制提供新的有價值的實驗依據(jù)。 方法：①兔PBMSCs的分離、培養(yǎng)與表型鑒定：選用2～3月齡日本大耳白兔，按30μg/（kg·d）劑量連續(xù)于背部皮下注射G-CSF動員6d，第7d自主動脈取兔外周血40ml，采用密度梯度離心法分離出單個核細胞，用紅細胞裂解液清除混入的紅細胞，用含15%FBS的改良型α-MEM，于37oC、5%CO2飽和濕度環(huán)境下進行PBMSCs原代培養(yǎng)，適時換液并棄除未貼壁的其他細胞，待貼壁細胞生長匯合度達80%～90%時，按2～5×105/ml細胞密度進行傳代培養(yǎng)。取第2代細胞，以免疫細胞化學染色法對分離培養(yǎng)的兔PBMSCs進行CD90、CD105、CD44、CD34、CD45表型鑒定。②兔股骨頭壞死模型的制備：采用3～4月齡日本大耳白兔，使用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉動物（劑量為30mg/kg），無菌條件下手術逐層鈍性分離臀肌以暴露股骨頭；無菌棉簽蘸取液氮，對股骨頭軟骨面負重區(qū)進行反復冷凍、復溫以制備股骨頭壞死模型。③動物分組與細胞移植：實驗分為正常對照組、模型組、髓芯減壓組和髓芯減壓+PBMSCs移植組。液氮冷凍后，用直徑1.2mm鉆頭從髓芯減壓組和細胞移植組兩組動物股骨頸的內(nèi)后側與股骨頸方向呈30度角手動鉆入股骨頭內(nèi)5mm，到達關節(jié)軟骨下，髓芯減壓組在鉆孔后即復位股骨頭；細胞移植組鉆孔后，自減壓孔注射入以300μl生理鹽水懸浮的第2～3代PBMSCs（細胞數(shù)為3～4×106個）；術后逐層縫合各組動物創(chuàng)口。③移植PKH26標記的PBMSCs的體內(nèi)定植示蹤及股骨頭組織損傷區(qū)域的組織病理學觀察：于術后2w、4w、6w、8w隨機選取各時間點各組實驗動物股骨頭，沿冠狀面剖開股骨頭，進行固定、脫鈣，制作冰凍切片（厚15μm）及常規(guī)石蠟切片（厚10μm），將冰凍切片DAPI復染后，置熒光顯微鏡下觀察移植細胞存活情況，石蠟切片經(jīng)Masson染色，置光鏡下觀察組織病理學變化情況。④移植PBMSCs后股骨頭局部細胞因子表-達的內(nèi)環(huán)境變化：將部分股骨頭樣本置于液氮中保存，用于實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)，以檢測不同時間點各組股骨頭內(nèi)BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1、VEGF-A及CCL2mRNA的表達情況。 結果：①家兔PBMSCs培養(yǎng)形態(tài)與表型特征：原代培養(yǎng)第5d時，可見較多貼壁細胞，細胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形，以梭形為主，可達20%～30%融合率，培養(yǎng)到10d左右時，細胞生長匯合度達80%以上；傳代培養(yǎng)的PBMSCs形態(tài)均一，呈梭形漩渦狀生長。免疫細胞化學染色結果顯示，PBMSCs表達CD90、CD105、CD44，，不表達CD34、CD45。②移植PKH26標記的PBMSCs的體內(nèi)定植及存活分析：熒光顯微鏡下的觀察結果顯示移植PKH26標記的PBMSCs移植后第2w、4w、6w、8w兔股骨頭移植部位均存在PKH26標記的陽性移植細胞，且隨時間點的推移，移植PBMSCs定植存活細胞的數(shù)量逐漸減少。③兔股骨頭的Masson染色組織病理學分析：鏡下可見正常組軟骨下區(qū)域的骨小梁完整，排列規(guī)律，大部分為紅染的成熟骨組織；2w時模型組骨小梁斷裂，排列紊亂，大部分為綠染的新生骨組織，骨小梁中骨細胞空骨陷窩增多，髓芯減壓組與移植組也可見被染上綠色的骨小梁；4w時模型組骨小梁較細，綠染不均勻，新生骨質(zhì)開始增加，髓芯減壓組與移植組部分骨小梁呈現(xiàn)較均勻綠染并出現(xiàn)片狀紅染；6w時模型組股骨頭軟骨下區(qū)域的骨小梁大部分為綠染的新生骨組織，髓芯減壓組與移植組可見條狀綠染的骨小梁；8w時模型組紅染的成熟骨組織區(qū)域增大，骨小梁稀疏，軟骨下的骨質(zhì)比較薄，髓芯減壓組紅染區(qū)域擴大，骨小梁稀疏，骨質(zhì)比較薄，移植組骨小梁呈現(xiàn)紅綠相間，骨小梁較另兩組密集，其間點狀紅染區(qū)域與綠染區(qū)域相間分布。④股骨頭局部組織細胞因子表達的RT-PCR檢測結果：模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)BMP-2mRNA的表達量均明顯低于正常組（P0.01）；細胞移植組各觀察時間點股骨頭內(nèi)BMP-2mRNA的表達量均高于模型組（P0.01或P0.05），細胞移植組股骨頭內(nèi)BMP-2mRNA的表達量與髓芯減壓組相比無統(tǒng)計學差異；模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)BMP-4mRNA的表達量均明顯低于正常組（P0.01），細胞移植組各觀察時間點股骨頭內(nèi)BMP-4mRNA的表達量均高于模型組（P0.01或P0.05），細胞移植組股骨頭內(nèi)BMP-4mRNA的表達量在2w時高于髓芯減壓組（P0.05），隨著時間的推移，細胞移植組BMP-4mRNA的表達量4w、6w、8w呈現(xiàn)出升高后降低的變化（P0.05）；模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)PDGF-βmRNA的表達量均低于正常組（P0.05或P0.01），細胞移植組在各觀察時間點時股骨頭內(nèi)PDGF-β mRNA的表達量均明顯高于模型組（P0.01），細胞移植組股骨頭內(nèi)PDGF-β mRNA的表達量在4w、8w時高于髓芯減壓組（P0.05）；模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)TGF-β1mRNA的表達量均明顯低于正常組（P0.01），細胞移植組在各觀察時間點股骨頭內(nèi)TGF-β1mRNA的表達量均顯著高于模型組（P0.01），細胞移植組股骨頭內(nèi)TGF-β1mRNA的表達量在8w時高于髓芯減壓組（P0.05）隨著時間的推移，細胞移植組TGF-β1mRNA在2w、4w時的表達量均呈現(xiàn)出升高的變化（P0.05）；模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達量均明顯低于正常組（P0.01），細胞移植組在各觀察時間點股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達量均高于模型組（P0.05或P0.01），其中6w、8w時髓芯減壓組股骨頭內(nèi)VEGF-AmRNA的表達量明顯均高于模型組（P0.01），細胞移植組股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達量與髓芯減壓組沒有統(tǒng)計學差異；模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)CCL2mRNA的表達量均高于正常組（P0.05），細胞移植組在各觀察時間點股骨頭內(nèi)CCL2mRNA的表達量均明顯低于模型組（P0.01），細胞移植組股骨頭內(nèi)CCL2mRNA的表達量在各觀察時間點均低于髓芯減壓組（P0.05或P0.01)。 結論：移植的兔PBMSCs能夠在兔股骨頭壞死的原位組織中定植存活至少8w。移植PBMSCs所發(fā)揮的股骨頭壞死修復作用可能與病損局部內(nèi)環(huán)境中參與骨組織損傷修復及改善血供的BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1及VEGF-A等細胞因子的表達變化有關。
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【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R681.8

【參考文獻】

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本文編號：2332019