【摘要】：目的：本課題是在課題組既往研究已證實(shí)原位移植兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(PBMSCs)對(duì)于液氮冷凍兔股骨頭壞死模型具有治療效應(yīng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提供移植PBMSCs的體內(nèi)定植與存活情況以及移植后股骨頭病損區(qū)域以細(xì)胞因子為主的內(nèi)環(huán)境改變情況，為闡明PBMSCs移植治療股骨頭壞死的可能機(jī)制提供新的有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：①兔PBMSCs的分離、培養(yǎng)與表型鑒定：選用2～3月齡日本大耳白兔，按30μg/（kg·d）劑量連續(xù)于背部皮下注射G-CSF動(dòng)員6d，第7d自主動(dòng)脈取兔外周血40ml，采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液清除混入的紅細(xì)胞，用含15%FBS的改良型α-MEM，于37oC、5%CO2飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行PBMSCs原代培養(yǎng)，適時(shí)換液并棄除未貼壁的其他細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，按2～5×105/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞，以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)分離培養(yǎng)的兔PBMSCs進(jìn)行CD90、CD105、CD44、CD34、CD45表型鑒定。②兔股骨頭壞死模型的制備：采用3～4月齡日本大耳白兔，使用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉動(dòng)物（劑量為30mg/kg），無(wú)菌條件下手術(shù)逐層鈍性分離臀肌以暴露股骨頭；無(wú)菌棉簽蘸取液氮，對(duì)股骨頭軟骨面負(fù)重區(qū)進(jìn)行反復(fù)冷凍、復(fù)溫以制備股骨頭壞死模型。③動(dòng)物分組與細(xì)胞移植：實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、髓芯減壓組和髓芯減壓+PBMSCs移植組。液氮冷凍后，用直徑1.2mm鉆頭從髓芯減壓組和細(xì)胞移植組兩組動(dòng)物股骨頸的內(nèi)后側(cè)與股骨頸方向呈30度角手動(dòng)鉆入股骨頭內(nèi)5mm，到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下，髓芯減壓組在鉆孔后即復(fù)位股骨頭；細(xì)胞移植組鉆孔后，自減壓孔注射入以300μl生理鹽水懸浮的第2～3代PBMSCs（細(xì)胞數(shù)為3～4×106個(gè)）；術(shù)后逐層縫合各組動(dòng)物創(chuàng)口。③移植PKH26標(biāo)記的PBMSCs的體內(nèi)定植示蹤及股骨頭組織損傷區(qū)域的組織病理學(xué)觀(guān)察：于術(shù)后2w、4w、6w、8w隨機(jī)選取各時(shí)間點(diǎn)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭，沿冠狀面剖開(kāi)股骨頭，進(jìn)行固定、脫鈣，制作冰凍切片（厚15μm）及常規(guī)石蠟切片（厚10μm），將冰凍切片DAPI復(fù)染后，置熒光顯微鏡下觀(guān)察移植細(xì)胞存活情況，石蠟切片經(jīng)Masson染色，置光鏡下觀(guān)察組織病理學(xué)變化情況。④移植PBMSCs后股骨頭局部細(xì)胞因子表-達(dá)的內(nèi)環(huán)境變化：將部分股骨頭樣本置于液氮中保存，用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，以檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組股骨頭內(nèi)BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1、VEGF-A及CCL2mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：①家兔PBMSCs培養(yǎng)形態(tài)與表型特征：原代培養(yǎng)第5d時(shí)，可見(jiàn)較多貼壁細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形，以梭形為主，可達(dá)20%～30%融合率，培養(yǎng)到10d左右時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%以上；傳代培養(yǎng)的PBMSCs形態(tài)均一，呈梭形漩渦狀生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，PBMSCs表達(dá)CD90、CD105、CD44，，不表達(dá)CD34、CD45。②移植PKH26標(biāo)記的PBMSCs的體內(nèi)定植及存活分析：熒光顯微鏡下的觀(guān)察結(jié)果顯示移植PKH26標(biāo)記的PBMSCs移植后第2w、4w、6w、8w兔股骨頭移植部位均存在PKH26標(biāo)記的陽(yáng)性移植細(xì)胞，且隨時(shí)間點(diǎn)的推移，移植PBMSCs定植存活細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。③兔股骨頭的Masson染色組織病理學(xué)分析：鏡下可見(jiàn)正常組軟骨下區(qū)域的骨小梁完整，排列規(guī)律，大部分為紅染的成熟骨組織；2w時(shí)模型組骨小梁斷裂，排列紊亂，大部分為綠染的新生骨組織，骨小梁中骨細(xì)胞空骨陷窩增多，髓芯減壓組與移植組也可見(jiàn)被染上綠色的骨小梁；4w時(shí)模型組骨小梁較細(xì)，綠染不均勻，新生骨質(zhì)開(kāi)始增加，髓芯減壓組與移植組部分骨小梁呈現(xiàn)較均勻綠染并出現(xiàn)片狀紅染；6w時(shí)模型組股骨頭軟骨下區(qū)域的骨小梁大部分為綠染的新生骨組織，髓芯減壓組與移植組可見(jiàn)條狀綠染的骨小梁；8w時(shí)模型組紅染的成熟骨組織區(qū)域增大，骨小梁稀疏，軟骨下的骨質(zhì)比較薄，髓芯減壓組紅染區(qū)域擴(kuò)大，骨小梁稀疏，骨質(zhì)比較薄，移植組骨小梁呈現(xiàn)紅綠相間，骨小梁較另兩組密集，其間點(diǎn)狀紅染區(qū)域與綠染區(qū)域相間分布。④股骨頭局部組織細(xì)胞因子表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：模型組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-2mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組（P0.01）；細(xì)胞移植組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-2mRNA的表達(dá)量均高于模型組（P0.01或P0.05），細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)BMP-2mRNA的表達(dá)量與髓芯減壓組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；模型組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-4mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組（P0.01），細(xì)胞移植組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-4mRNA的表達(dá)量均高于模型組（P0.01或P0.05），細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)BMP-4mRNA的表達(dá)量在2w時(shí)高于髓芯減壓組（P0.05），隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞移植組BMP-4mRNA的表達(dá)量4w、6w、8w呈現(xiàn)出升高后降低的變化（P0.05）；模型組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)PDGF-βmRNA的表達(dá)量均低于正常組（P0.05或P0.01），細(xì)胞移植組在各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)時(shí)股骨頭內(nèi)PDGF-β mRNA的表達(dá)量均明顯高于模型組（P0.01），細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)PDGF-β mRNA的表達(dá)量在4w、8w時(shí)高于髓芯減壓組（P0.05）；模型組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)TGF-β1mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組（P0.01），細(xì)胞移植組在各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)TGF-β1mRNA的表達(dá)量均顯著高于模型組（P0.01），細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)TGF-β1mRNA的表達(dá)量在8w時(shí)高于髓芯減壓組（P0.05）隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞移植組TGF-β1mRNA在2w、4w時(shí)的表達(dá)量均呈現(xiàn)出升高的變化（P0.05）；模型組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組（P0.01），細(xì)胞移植組在各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量均高于模型組（P0.05或P0.01），其中6w、8w時(shí)髓芯減壓組股骨頭內(nèi)VEGF-AmRNA的表達(dá)量明顯均高于模型組（P0.01），細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量與髓芯減壓組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；模型組各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)CCL2mRNA的表達(dá)量均高于正常組（P0.05），細(xì)胞移植組在各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)CCL2mRNA的表達(dá)量均明顯低于模型組（P0.01），細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)CCL2mRNA的表達(dá)量在各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)均低于髓芯減壓組（P0.05或P0.01)。 結(jié)論：移植的兔PBMSCs能夠在兔股骨頭壞死的原位組織中定植存活至少8w。移植PBMSCs所發(fā)揮的股骨頭壞死修復(fù)作用可能與病損局部?jī)?nèi)環(huán)境中參與骨組織損傷修復(fù)及改善血供的BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1及VEGF-A等細(xì)胞因子的表達(dá)變化有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R681.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2332019