【摘要】：目的：方證相關(guān)及其生物學(xué)基礎(chǔ)是中醫(yī)方劑學(xué)中的重要問題。而中醫(yī)證候模型是方證關(guān)系研究中的重要工具,目前由于中醫(yī)證的內(nèi)涵缺乏確定性,而基于現(xiàn)代疾病為背景的病證結(jié)合模型以其具有較為明確的病生理基礎(chǔ)而更多地受到重視。目前關(guān)于病證結(jié)合模型的評價還只是停留于中醫(yī)證候外觀表征與系統(tǒng)病生理層面,很少有研究在整體分子層面上(如蛋白組學(xué))對其進行評價。本課題擬在前人研究基礎(chǔ)上,從病證結(jié)合的角度,應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù),對單純高脂高糖喂飼和高脂高糖喂飼聯(lián)合一次性腹腔注射STZ復(fù)制出的兩種T2DM大鼠模型的西醫(yī)病理和中醫(yī)證候及血清蛋白組學(xué)特征進行比較觀察,從“中醫(yī)證候表征-系統(tǒng)病生理-蛋白質(zhì)組學(xué)”不同維度上評價兩種模型的生物學(xué)特點,探查其潛在的病、證生物學(xué)標(biāo)志物；在此基礎(chǔ)上觀察了益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方對高脂高糖聯(lián)合STZ復(fù)制的T2DM氣陰兩虛痰瘀證大鼠模型的治療作用及探查其分子作用靶標(biāo),以揭示該方與該病證相關(guān)的生物學(xué)基礎(chǔ)。方法：1.模型評價：健康雄性SD大鼠35只,隨機分為正常組、高脂高糖組、高脂高糖聯(lián)合STZ組。其中正常組大鼠給予正常飼料,高脂高糖組和高脂高糖聯(lián)合STZ組大鼠給予高脂高糖飼料,所有大鼠連續(xù)飼養(yǎng)12周。于實驗第36天,高脂高糖聯(lián)合STZ組大鼠一次性腹腔注射30mg/kg STZ,3天后尾靜脈采血檢測血糖,選擇空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠納入。12周末,觀察并記錄大鼠外觀表征(毛發(fā)色澤、行為狀態(tài)、情緒、舌質(zhì)、臀尾評分、體重、飲食量、飲水量、大便量、小便量、抓握力),乙醚麻醉后腹主動脈采血、快速分離臟器組織。(1)實驗室檢測：糖化血紅蛋白(GHbAlc)、血清胰島素(Fins)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、血栓素B2 (TXB2)、6-酮前列腺素Fla (6-keto PGFla)、內(nèi)皮素(ET-1)、肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-2(GLUT-2)、肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(GLUT-4)、脂肪葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(GLUT-4)。(2)血清蛋白組學(xué)檢測。2.藥物治療作用評價及靶標(biāo)探查：健康雄性SD大鼠75只,隨機分為正常組(10只)、造模組(65只)。其中正常組大鼠給予正常飼料,造模組大鼠給予高脂高糖飼料,于實驗第36天,造模組大鼠一次性腹腔注射30mg/kg鏈脲佐菌素,3天后尾靜脈采血檢測血糖,選擇空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠列入模型組。10周末將模型組大鼠隨機分為高脂高糖聯(lián)合STZ組、鹽酸吡格列酮組(2.7mg·kg-1*天-’)、益氣養(yǎng)陰方組(3.37g生藥·kg-1·天-1)、益氣養(yǎng)陰化痰方組(3.84g生藥·kg-1·天-1)、益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方組(4.80g生藥·kg-1·天-1),各組大鼠連續(xù)灌胃給藥14天。觀察并記錄正常組、高脂高糖聯(lián)合STZ組、鹽酸吡格列酮組、益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方組大鼠外觀表征(毛發(fā)色澤、行為狀態(tài)、情緒、舌質(zhì)、臀尾評分、體重、飲食量、飲水量、大便量、小便量、抓握力),于12周末,采集各組大鼠血液和臟器組織。實驗室檢測指標(biāo)同上。運用血清蛋白組學(xué)技術(shù)分別檢測正常組、高脂高糖聯(lián)合STZ組、鹽酸吡格列酮組、益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方組血清蛋白表達情況。結(jié)果：1.模型評價：(1)高脂高糖組模型：大鼠出現(xiàn)毛發(fā)油膩、脫毛,嗜睡少動、舌淡、臀尾潮濕、色暗,多飲、多食、多尿、多便,FBG、cGMP含量顯著升高,抓握力、ISI水平、肝臟GLUT-2、肌肉GLUT-4、脂肪GLUT-4含量、cAMP/cGMP比值、HDL-C、 6-keto PGF1α含量顯著下降；血清差異蛋白101個(上調(diào)55個、下調(diào)46個),其涉及153條生物學(xué)途經(jīng),存在顯著差異的信號通路11條,差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)2個。(2)高脂高糖聯(lián)合STZ組模型：大鼠出現(xiàn)毛發(fā)油膩、脫毛,萎靡扎堆,舌、尾瘀斑,多飲、多食、多尿、多便、消瘦、抓握力顯著減弱,FBG、HOMA-IR、 Fins、GHbAlc、cGMP、 TC、LDL-C含量、TXB2/6-keto PGFla比值顯著升高,ISI水平、肝臟GLUT-2.肌肉GLUT-4.脂肪GLUT-4、cAMP含量、cAMP/cGMP比值、HDL-C、6-keto PGF1α含量顯著下降；血清差異蛋白48個(上調(diào)40個、下調(diào)8個),其涉及20條生物學(xué)途經(jīng),存在顯著差異的信號通路4條,差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)2個；選擇性ELISA驗證結(jié)果顯示血清FCN2、 apoC4、apoB100、CYR61蛋白表達量明顯升高。(3)高脂高糖組與高脂高糖聯(lián)合STZ組比較,共有差異蛋白97個(上調(diào)37個、下調(diào)60個)、無顯著變化蛋白32個,差異蛋白涉及116條生物學(xué)途經(jīng),存在顯著差異的信號通路13條,差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)2個；與高脂高糖組相比,高脂高糖聯(lián)合STZ組大鼠血清a1I3蛋白表達量顯著下調(diào),血清HSP71、FXII、PPKARIA、FCN2蛋白表達量顯著上調(diào),血清UN13D、LBP蛋白表達量無明顯差異。2.藥物治療作用評價及靶標(biāo)探查：(1)益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方組：顯著改善T2DM氣陰兩虛痰瘀證大鼠的外觀表征(皮毛、行為、情緒、舌、尾部瘀斑),顯著升高攝食量、體重、抓握力、ISI、肝臟GLUT-2、肌肉GLUT-4、脂肪GLUT-4、cAMP、cAMP/cGMP、 6-keto PGF1α水平,顯著降低飲水量、大便量、FBG、GHbAlc、Fins、HOMA-IR、cGMP、 TG、TC、LDL-C、TXB2、TXB2/6-keto PGF1α、ET-1水平；益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方治療后共有23個差異蛋白(上調(diào)5個、下調(diào)18個),其涉及7條生物學(xué)途徑；ELISA結(jié)果顯示,CDC42、RhoA、CYR61在高脂高糖聯(lián)合STZ組中顯著升高,在益氣養(yǎng)陰方、益氣養(yǎng)陰化痰方、益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方治療后有不同程度的降低,且益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方作用效果最好。(2)鹽酸吡格列酮組：顯著改善T2DM氣陰兩虛痰瘀證大鼠的外觀表征(皮毛、行為、情緒、舌),顯著升高攝食量、體重、抓握力、ISI、肝臟GLUT-2、肌肉GLUT-4、脂肪GLUT-4、 cAMP、6-keto PGF1α水平,顯著降低飲水量、大便量、小便量、FBG、GHbA1c、Fins、HOMA-IR、cGMP、TG、TC、LDL-C、TXB2、TXB2/6-keto PGF1α、ET-1水平;鹽酸吡格列酮治療后共有12個差異蛋白(上調(diào)1個、下調(diào)11個)。(3)兩種藥物比較共有8個相似的治療靶標(biāo)。結(jié)論：1.模型評價：(1)在實驗12周末,兩種造模方法均可以成功復(fù)制出T2DM大鼠模型,并表現(xiàn)出不同程度的中醫(yī)氣陰兩虛及痰濁血瘀的證候表征,其中高脂高糖模型大鼠處于T2DM初期,伴有明顯的氣陰兩虛證,病機上開始涉及到痰濁和血瘀；高脂高糖飲食聯(lián)合STZ復(fù)制的模型大鼠T2DM損傷較重,伴有更為明顯的氣陰兩虛痰瘀證的變化。(2)兩種方法復(fù)制的T2DM病證結(jié)合模型產(chǎn)生的機制在胰島素分泌、凝血、糖酵解方面確有不同；炎癥損傷是二者產(chǎn)生的共同機制,但引起炎癥損傷的誘因不盡相同。(3)FCN2、apoC4和apoB100和可作為潛在的T2DM生物標(biāo)志物,CYR61可作為潛在的氣陰兩虛痰瘀證生物標(biāo)志物。2.藥物治療作用評價及靶標(biāo)探查：(1)益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方與鹽酸吡格列酮對T2DM氣陰兩虛痰瘀證具有一定程度上的治療作用。(2)益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方可通過顯著改善大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白激酶活性等生物學(xué)功能相關(guān)蛋白的含量來治療T2DM氣陰兩虛痰瘀證,從而實現(xiàn)對T2DM氣陰兩虛痰瘀證及其并發(fā)癥的多通路、多靶點治療。(3)CDC42、RhoA、CYR61同是益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方治療T2DM氣陰兩虛痰瘀證的潛在靶標(biāo)之一。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn),高脂高糖飲食聯(lián)合STZ法誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型具有明顯的中醫(yī)氣陰兩虛痰瘀證特點,通過血清蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)FCN2、apoC4和apoB100可作為潛在的T2DM生物標(biāo)志物、CYR61是氣陰兩虛痰瘀證的可能生物標(biāo)志物；因證組方方藥(益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方)對此T2DM氣陰兩虛痰瘀證模型具有一定的治療作用,通過血清蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)其作用的潛在靶標(biāo)有CDC42、RhoA、CYR61。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5
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本文編號：2326230