【摘要】：背景 應(yīng)激是指個體面臨或察覺(認(rèn)知、評價)到環(huán)境變化(應(yīng)激原)對機(jī)體有威脅或挑戰(zhàn)時做出的適應(yīng)和應(yīng)對的過程。適度的應(yīng)激能夠活化思維、提高人們的警覺性和工作效率,但超過個體承受能力的應(yīng)激壓力,則往往會誘發(fā)多種疾病。心臟是應(yīng)激作用的主要靶器官之一,多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展與應(yīng)激機(jī)制的激活密切相關(guān)。 運(yùn)動是一種特殊的應(yīng)激,適宜的運(yùn)動能夠提高心臟的功能,如心肌纖維增粗、收縮力增強(qiáng)等,而力竭運(yùn)動或過度訓(xùn)練則對心臟具有消極作用,不僅不利于心臟功能的提高,還會使心肌受到損傷,使心臟發(fā)生病理性改變,生活中經(jīng)常遇到的猝死現(xiàn)象就證明了這一點(diǎn)。有研究表明過度訓(xùn)練引起的心肌損傷(overtraining-induced acute myocardial injury, OTIAMI)是猝死的重要原因之一,目前還沒有效的防治措施。因此,如何進(jìn)一步認(rèn)識OTIAMI的發(fā)病機(jī)理,探索其防治措施是當(dāng)今運(yùn)動醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)面臨的重大課題。 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是一種經(jīng)典的抗氧化劑和自由基清除劑,可以有效得提高心臟谷胱甘肽的含量,阻止高血壓時高濃度的TNF-α對心臟的毒害作用。同時谷胱甘肽還能夠通過改善心肌氧化還原狀態(tài)抑制NF-κB的激活,使肥大的心臟得到復(fù)原,從而改善高血壓心臟重構(gòu),提高重構(gòu)心臟的收縮力。大鼠心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)表明NAC能明顯降低血清心肌肌鈣蛋白I (cardiac troponin I, cTnI)和脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation, LPO)的水平,顯著縮小心肌梗死面積。也有研究證實(shí)NAC可通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá),進(jìn)而抑制NF-κB的活性,導(dǎo)致其下游細(xì)胞因子減少,通過TLR4/NF-κB途徑降低心肌細(xì)胞凋亡率,從而起到心肌保護(hù)效應(yīng)。不僅如此,NAC預(yù)處理還可明顯減少細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生,減輕細(xì)胞線粒體膜電位的崩潰及caspase的活化。然而,NAC對OTIAMI是否具有防治作用及其作用機(jī)制尚不清楚。本課題通過反復(fù)游泳力竭應(yīng)激建立過度訓(xùn)練致心肌損傷動物模型,研究細(xì)胞色素c (cytochrome c, CytC)、程序性細(xì)胞凋亡因子5(programmed cell death5, PDCD5)和心肌損傷的關(guān)系,觀察力竭游泳應(yīng)激對心肌的影響及NAC對OTIAMI是否具有防治作用,為進(jìn)一步認(rèn)識OTIAMI的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.動物分組及模型建立：36只雄性Wistar大鼠,4-5周齡,體質(zhì)量(110±20)g,購回后,適應(yīng)性游泳2次,每日1次每次20min,剔除異常鼠。次日進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),稱重后,隨機(jī)分為3組：對照組(C組)、應(yīng)激組(S組)和應(yīng)激+NAC干預(yù)組(N組),每組12只。N組每天用NAC150mg/kg灌胃,每日1次,連續(xù)7周,其他組給予等量的雙蒸水。灌胃30min后負(fù)5%體重自制重物進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練(C組不運(yùn)動)。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠游泳動作協(xié)調(diào)性明顯下降,水淹沒鼻,沉入水中10s不能浮出水面連續(xù)3次,且撈出后放在平面無法迅速完成翻正反射者。游泳條件：SLY-WMS水迷宮,內(nèi)壁光滑,直徑1.2m,深0.5m,沒有平臺,帶自動時間和溫控裝置,實(shí)驗(yàn)時設(shè)置水深45cm,水溫(30±2)℃,大鼠不能逃離,不能觸底。 2.取材：每組于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻取材。10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,仰臥位固定,四肢插入心電電極,用Power-lab記錄儀和1050.1型壓力換能器連續(xù)記錄5分鐘心率、ECG變化,觀察心律失常的發(fā)生情況。術(shù)野備皮消毒,頸部正中切開,行氣管切開后插入16G套管針,連接呼吸機(jī)行人工呼吸,不連接氧氣裝置。胸骨下段縱切口,以血管鉗經(jīng)劍突下探人胸骨后,鈍性分離后將胸骨正中劈開至第三前肋旁,縫扎胸骨止血。將22G套管針沿心臟長軸方向刺人心尖約3mm,連接測壓裝置,動態(tài)觀察左心室壓變化。記錄完成后自測壓管采血2-3ml,靜置1h,3600r/min,4℃離心10min,留取血清-70℃冰箱保存。同時用DEPC水浸泡過的剪刀和鑷子小心留取左室游離壁心肌標(biāo)本,其中部分標(biāo)本用4%甲醛固定,24h后行常規(guī)石蠟包埋,備用；剩余的標(biāo)本則切成3mm厚的薄片,浸入4℃3%戊二醛固定液中,沖洗脫水后,環(huán)氧樹脂包埋,用超薄切片機(jī)切成50um超薄切片后置入銅網(wǎng)上,用1%-2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察。對照組除不游泳訓(xùn)練外,其他處理方法同實(shí)驗(yàn)組,在實(shí)驗(yàn)組大鼠處死的同時,處死對照組。 3.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測：實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠體重、飲食、運(yùn)動能力的變化；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用Powedab16導(dǎo)生理記錄儀記錄心率、心電圖變化及各項(xiàng)心臟血流動力學(xué)指標(biāo),比較各組大鼠的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)、心臟重量指數(shù)和心室重量指數(shù)；采用光鏡觀察心肌病理形態(tài),電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。T-SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,抽提法檢測CuZn-SOD、Mn-SOD活性；MDA采用硫化巴比妥酶法測定,心肌組織蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭法。并采用實(shí)時熒光定量PCR檢測心肌細(xì)胞程序性細(xì)胞凋亡因子5(programmed cell death5, PDCD5) mRNA表達(dá)；Western blot檢測心肌細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C(CytC)的蛋白表達(dá)：酶聯(lián)免疫法測定血清心肌肌鈣蛋白I (TNNI3)和血清肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)的含量。 4統(tǒng)計方法：所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn),組間比較用單因素方差分析,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.一般情況的觀察：大鼠游泳訓(xùn)練至第4周時,應(yīng)激組有1只精疲力盡溺水衰竭,第6周時應(yīng)激組又有1只出現(xiàn)溺水衰竭。經(jīng)過7周負(fù)重游泳訓(xùn)練后,應(yīng)激組大鼠神態(tài)倦怠,毛發(fā)脫落明顯,眼睛變得暗淡無光,反應(yīng)能力明顯降低,易受驚嚇,同時在運(yùn)動訓(xùn)練后期,易發(fā)生抽搐。對照組大鼠神態(tài)安靜,皮毛光潔整齊,眼睛有神,反應(yīng)敏捷,活潑好動。對照組體重增長比應(yīng)激組快,前3周兩組均呈正性增長。但應(yīng)激組增長較對照組慢,第4周起體重(272.68±16.96g)不再增長,隨著力竭游泳應(yīng)激天數(shù)的增加,體重有下降的趨勢,與對照組(345.98±23.11g)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.603,PO.05)。對照組大鼠在整個實(shí)驗(yàn)期內(nèi)飲食量也呈正性增長。對照組實(shí)驗(yàn)后飲食量(36.53±3.02g)比實(shí)驗(yàn)前(21.23±1.86g)增長明顯,為72.1%(t=31.882,P0.05),而應(yīng)激組大鼠在實(shí)驗(yàn)前3周飲食量呈正性增長,從第4周開始飲食量呈負(fù)性增長,實(shí)驗(yàn)?zāi)╋嬍沉?21.32±2.75g)比實(shí)驗(yàn)前(20.89±1.78)僅增加2.1%,變化無統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.913,P0.05),比實(shí)驗(yàn)期最大飲食量(第3周飲食量)(32.15±3.32g)減少33.7%差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=29.762,P0.05)。 2.心肌病理及超微結(jié)構(gòu)的變化：光鏡觀察發(fā)現(xiàn),游泳力竭應(yīng)激大鼠心肌纖維腫脹肥大、水腫,部分見心肌間血管及毛細(xì)血管擴(kuò)張；應(yīng)激+NAC干預(yù)組心肌纖維輕度腫脹、水腫,偶見心肌間血管及毛細(xì)血管擴(kuò)張；對照組未發(fā)現(xiàn)明顯異常。不同組別大鼠心尖部組織透射電鏡觀察：對照組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)正常,肌節(jié)排列整齊,Z線、M線、I帶、A帶清晰;線粒體呈帶狀分布,排列整齊,形態(tài)正常；血管管腔光滑,基底膜正常。應(yīng)激+NAC干預(yù)組大鼠大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)未見明顯異常,明暗帶清楚,僅個別線粒體腫脹。力竭游泳應(yīng)激后大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整度破壞,大部分肌絲溶解,Z線明顯增粗向I帶延伸；心肌細(xì)胞核明顯水腫,肌纖維基質(zhì)水腫；線粒體內(nèi)形成許多同心圓狀結(jié)晶,腫脹明顯,有的基質(zhì)溶解呈空泡結(jié)構(gòu),核膜還基本完整。 3.血清CK-MB及TNNI3含量的變化：本實(shí)驗(yàn)三組大鼠血清CK-MB和TNNI3值統(tǒng)計分析采用單因素方差分析,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(CK-MB:F=429.183, df=2, P0.05; TNNI3: F=257.953, df=2, P0.05)。進(jìn)一步多重比較采用LSD法：與C組CK-MB (8.866±0.950)pg/ml、TNNI3(84.854±11.574)pg/ml比較,S組血清CK-MB(19.343±0.944) pg/ml、TNNI3(198.107±12.060) pg/ml水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與S組CK-MB (19.343±0.944) pg/ml、TNNI3(198.107±12.060) pg/ml相比,N組血清CK-MB (11.998±0.634) pg/ml、TNNI3(128.265±11.489) pg/ml水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(PO.05),但仍高于對照組C組CK-MB (8.866±0.950) pg/ml、 TNNI3(84.854±11.574) pg/ml (P0.05)。 4.三組大鼠心肌組織T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活性及MDA含量的比較：本組整體而言組間均數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(T-SOD:F=130.739, df=2,P0.05; CuZn-SOD: F=65.098, df=2,P0.05; Mn-SOD:F=43.234, df=2,P0.05; MDA:F=43.703, df=2, P0.05),兩兩比較采用LSD法：與C組(T-SOD:160.638±9.419U/mgprot, CuZn-SOD:118.724±7.187U/mgprot,Mn-SOD:41.915±7.508U/mgprot)比較,S組大鼠心肌組織的各超氧化物歧化酶活性明顯降低(T-SOD:126.435±6.368U/mgprot, CuZn-SOD:96.809±4.998U/mgprot,Mn-SOD:29.626±8.595U/mgprot),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與S組比較,N組大鼠心肌組織的各超氧化物歧化酶活性明顯升高(T-SOD:197.619±13.334U/mgprot,CuZn-SOD:137.345±11.042U/mgprot, Mn-SOD:60.274±7.426U/mgprot)(P0.05),并且高于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(PO.05)。與C組(1.343±0.104nmol/mgprot)相比,S組大鼠心肌組織的MDA含量顯著升高(1.913±0.206nmol/mgprot),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與S組比較,N組大鼠心肌組織的MDA含量顯著降低(1.407±0.144nmol/mgprot)(P0.05),雖然仍高于C組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5.各組心肌組織CytC蛋白及PDCD5mRNA的表達(dá)結(jié)果：本組整體而言組間均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(CytC:F=79.497, df=2, P0.05; PDCD5mRNA:F=73.290, df=2, P0.05),具體如下所述。心肌組織CytC蛋白的表達(dá)：兩組間目的蛋白條帶與同一樣品GAPDH的比值進(jìn)行比較,Western blot結(jié)果顯示：與C組比較,S組和N組CytC蛋白的表達(dá)量均增高(0.485±0.161；0.381±0.326VS0.327±0.120),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；給予NAC干預(yù)后,N組CytC蛋白的表達(dá)(0.381±0.326)較S組(0.485±0.161)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；但仍高于對照組C,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,)。各組心肌組織PDCD5mRNA的表達(dá)：所有檢測目的基因溶解曲線均為單峰,產(chǎn)物特異性良好。對PDCD5mRNA的表達(dá)量采用2-AACT法進(jìn)行評估,與C組相比較,S組和N組PDCD5mRNA的表達(dá)均增高(2.297±0.098；1.739±0.065VS1.060±0.065),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)：給予NAC干預(yù)后,N組PDCD5mRNA的表達(dá)(1.739±0.065)較S組(2.297±0.098)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；但仍高于對照組C,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1.本研究所采用的“強(qiáng)迫游泳+負(fù)重”動物模型出現(xiàn)了明顯的食欲減退、體重減輕及反應(yīng)低下等改變,在心肌組織中也出現(xiàn)了明顯的病理改變,說明我們所采用的實(shí)驗(yàn)動物模型是成功的,可用于對OTIAMI的研究。 2.長期力竭游泳應(yīng)激會使心臟產(chǎn)生一系列病理及功能的改變,造成運(yùn)動性心臟超負(fù)荷,破壞心肌局部組織結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致心肌損傷。 3.NAC對OTIAMI具有防治的效果,可以通過其抗氧化作用來減輕大鼠心肌過度訓(xùn)練所致的過氧化損傷。 4.NAC能夠下調(diào)力竭游泳應(yīng)激后大鼠心肌細(xì)胞PDCD5mRNA的表達(dá),抑制CytC從線粒體向胞漿釋放,從而達(dá)到心肌保護(hù)的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉勇;殷桂林;朱水波;孫宗全;;胸骨下段切口制備大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型的評價[J];華南國防醫(yī)學(xué)雜志;2010年02期

2 馬蘭軍;田振軍;;黃芪多糖對力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞凋亡及BcL-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J];華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年02期

3 王榮平;余冬敏;高旭輝;朱水波;胡建才;劉高利;陳維海;;N-乙酰半胱氨酸對過度訓(xùn)練大鼠心肌過氧化損傷的保護(hù)作用[J];華南國防醫(yī)學(xué)雜志;2013年10期

4 郭輝;孫偉;馬秀敏;張彤;丁劍冰;;新的凋亡相關(guān)基因PDCD5在細(xì)胞凋亡中的作用及應(yīng)用前景[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2010年01期

5 李麗;常波;;過度訓(xùn)練動物模型制備的研究進(jìn)展[J];沈陽體育學(xué)院學(xué)報;2011年05期

6 孫強(qiáng);;運(yùn)動性肥大心臟心肌超微結(jié)構(gòu)改變的實(shí)驗(yàn)研究[J];四川體育科學(xué);2013年04期

7 朱志先,楊越秀,謝忠明;應(yīng)激性生活事件對室性心律失�；颊哐毫髯冃缘挠绊慬J];微循環(huán)學(xué)雜志;2004年02期

8 潘志軍;;運(yùn)動性猝死(英文)[J];中國臨床康復(fù);2006年40期

9 徐曉陽,馮煒權(quán),馮美云,曹建民,謝敏豪;大鼠運(yùn)動性低血睪酮與腎陽虛模型骨骼肌α-actin基因表達(dá)的比較研究[J];中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志;2000年02期

10 尹士優(yōu);龐立杰;張安民;胡淑萍;;過度訓(xùn)練后大鼠血清cTnⅠ、CK-MB和TNF-α變化及丹參的干預(yù)效應(yīng)[J];中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王榮平;TLR4信號通路在大鼠慢性應(yīng)激心肌損傷中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

，

本文編號：2319955