【摘要】：背景：每年都有數(shù)百萬的病人在實施全身麻醉的情況下,完成外科手術以及伴有疼痛刺激的醫(yī)學檢查操作。但是,近年來人們不斷地在新生動物模型中觀察到：全身麻醉能誘導出廣泛的腦神經元細胞凋亡,同時伴隨腦功能的長期性損害。且人類流行病學研究的結果也表明：曾在3歲以內接受過麻醉處理的小兒,在10歲時與同齡未接受過麻醉的兒童相比,存在發(fā)生語言、抽象推理缺陷以及學習障礙的高風險。目前越來越多的關注集中到全麻藥物腦神經毒性的研究上,尤其是對于那些腦發(fā)育處于高峰期而又需要接受外科手術治療的早產兒、新生兒、嬰幼兒和胎兒,全身麻醉藥物在這些患兒中的安全應用問題引起了廣大兒科臨床醫(yī)師、政府衛(wèi)生部門的密切關注和擔憂。并且已有的研究結果又提出了很多亟待解決的問題,如：為什么一些腦部區(qū)域相對于其它的腦區(qū),神經元細胞凋亡的程度更嚴重?為什么一些神經元細胞發(fā)生了凋亡,而與其毗鄰的神經元細胞看上去(形態(tài)學方法觀察)似乎沒有受到任何影響?為什么成年動物的大腦相較于新生動物的大腦,表現(xiàn)出對麻醉藥腦毒性作用的不敏感?雖然全麻藥物的腦神經毒性作用機制并不清楚,但是了解全身麻醉后腦神經元細胞凋亡的區(qū)域分布模式,即全麻藥物腦神經毒性的易感區(qū)域選擇性,這一點對于回答前面所提出的問題、解釋現(xiàn)象背后的發(fā)生機制至關重要。方法：第一部分 全身麻醉藥物的腦神經毒性具有依賴于年齡的區(qū)域選澤性新生期(P7)、青春期(P21)、成年期(P49)小鼠被隨機分入相應年齡組的麻醉組和無麻醉組。其中麻醉組(Anaesthesia)禁食、持續(xù)吸入1.5% Isoflurane(異氟烷)和[30% Oxygen (氧氣)+70% Nitrogen(氮氣)]的混合氣體6小時。而與此同時,無麻醉組(No Anaesthesia)、鼠吸入空氣并同時禁食6小時。所有麻醉組和無麻醉組的小鼠均予以腹膜內注射ketamine(20mg/kg)+acepromazine (0.5mg/kg)+xylazine (1 mg/kg)處死。即刻經左心室灌注含5% glycerol和5% su crose的冰冷PBS緩沖液；待自右心耳流出的血液轉變?yōu)槌吻宓墓嘞匆汉?再用含5%glycerol和5% sucrose的冰冷4%PFA(低聚甲醛)經心臟灌注。取出小鼠腦組織,用4%PFA固定,并制作腦組織冰凍切片。運用細胞凋亡標記物-Cleaved Caspase-3(AC3),對(1)DG—齒狀回的顆粒細胞下層-顆粒細胞層、(2)CAl—海馬CA1區(qū)的錐體細胞層、(3)RSA--大腦皮層RSA區(qū)的第2/3層、(4)CPu—紋狀體的caudoputamen區(qū)、(5)GrO—嗅球的顆粒細胞層、(6)Cb—小腦皮層、(7)Cbwm-小腦白質,共7個腦內區(qū)域行凋亡神經元細胞的定量分析；并在同一年齡組內,同一腦部區(qū)域,比較麻醉組與無麻醉組之間凋亡神經元細胞密度(AC3+/mm3)是否存在差異以及差異有無統(tǒng)計學意義。第二部分 全身麻醉藥物的腦神經毒性具有依賴于神經元細胞年齡的選擇性在不同年齡點接受腹膜內注射BrdU來標記腦內海馬齒狀回新生顆粒神經元細胞的小鼠以及未接受BrdU注射的小鼠(應用免疫組織化學染色方法標記不同成熟階段的海馬齒狀回顆粒神經元細胞)、在出生后21天(P21)時,給予禁食、持續(xù)吸入1.5%Isoflurane(異氟烷)和[30% Oxygen (氧氣)+70% Nitrogen (氮氣)]的混合氣體6小時。然后予以腹膜內注射ketamine (20 mg/kg)+acepromazine (0.5mg/kg)+xylazine(1 mg/kg)處死。即刻經左心室灌注含5%glycerol和5%sucrose的冰冷PBS緩沖液；待自右心耳流出的血液轉變?yōu)槌吻宓墓嘞匆汉?再用含5%glycerol和5%sucrose的冰冷4%PFA(低聚甲醛)經心臟灌注。取出小鼠腦組織,用4%PFA固定,制作腦組織冰凍切片和行免疫熒光組織化學染色。所應用的代表海馬齒狀回顆粒神經元細胞不同成熟階段的標記物包括：①標記早期神經祖細胞(early progenitors)的Sox2；②標記晚期神經祖細胞(late progenitors)的NeuroD1;③標記不成熟顆粒神經元細胞(immature granule cells) 的 calretinin;④標記成熟顆粒神經元細胞(mature granule cells)的calbindin。再與細胞凋亡標記物-Cleaved Caspase3 (AC3,效應子Caspase 3)相結合,行以下定量分析：①計算出所有BrdU+細胞中BrdU+/AC3+共免疫染色陽性細胞所占的比例,即(BrdU+-AC3+) /BrdU+比值。②計算出各總AC3+細胞中每一種成熟標記物免疫染色陽性的細胞所占的比例,即(Sox2+-AC3+)/AC3+比值,(NeuroD1+-AC3+)/AC3+比值,(calretinin+-AC3+)/AC3+比值,(calbindin+-AC3+)/AC3+比值。以上來證實腦內神經元細胞對于全麻誘導凋亡這一毒性作用存在著一個特殊的神經元細胞年齡的易感窗。結果：第一部分 全身麻醉藥物的腦神經毒性具有依賴于年齡的區(qū)域選擇性與無麻醉組相比,麻醉組中的P7小鼠在以下腦部區(qū)域的凋亡神經元細胞數(shù)量發(fā)生了具有統(tǒng)計學意義的增高：RSA區(qū)(11倍),CPu區(qū)(10倍),CA1區(qū)(3倍),Cb區(qū)(4倍)及GrO區(qū)(4倍)。更重要的發(fā)現(xiàn)是：標志神經元細胞凋亡的AC3陽性細胞計數(shù),在P21小鼠及P49小鼠的DG和GrO區(qū)仍保持具有統(tǒng)計學意義的增高,分別為P21小鼠(15倍和12倍),P49小鼠(2倍和4倍)。第二部分 全身麻醉藥物的腦神經毒性具有依賴于神經元細胞年齡的選擇性證實當神經元細胞的年齡在13天-15天時表現(xiàn)出對全麻藥物腦神經毒性最高的敏感性,而隨后凋亡神經元數(shù)量就大幅減少。同時運用海馬齒狀回(DG)內顆粒神經元細胞處于不同成熟階段的標記物：早期神經祖細胞Sox2、晚期神經祖細胞NeuroD1、不成熟顆粒神經元細胞calretinin、成熟顆粒神經元細胞calbindin行定量分析,證實晚期神經祖細胞(NeuroD1)口不成熟顆粒神經元細胞(calretinin),對持續(xù)6h吸入1.5% Isoflurane(異氟烷)誘導神經元細胞凋亡的神經毒性作用最敏感,而早期神經祖細胞和成熟的顆粒神經元細胞未受到明顯影響。結論：該研究在肯定了既往有關新生動物前腦對全身麻醉藥物腦神經毒性作用的高度易感性的基礎上,進一步發(fā)現(xiàn)這種易感性可以延續(xù)至成年動物,但是僅局限于能持續(xù)神經發(fā)生的DG(海馬齒狀回)和GrO(嗅球顆粒細胞層)區(qū)。全身麻醉藥物引發(fā)的腦神經元細胞凋亡是具有一定選擇性的。首先,全身麻醉藥物引發(fā)的腦神經元細胞凋亡是具有依賴于麻醉時動物年齡的區(qū)域選擇性的。麻醉誘導腦內神經元細胞廣泛性凋亡的易感時間窗,是在腦內不同區(qū)域各自的神經發(fā)生高峰時間窗后的1周～2周。其次,全麻藥物腦神經毒性選擇性不僅僅是簡單地由動物的年齡決定,而且是更精確的是取決于麻醉時,神經元細胞的年齡以及其成熟狀態(tài)。在海馬齒狀回,不成熟的顆粒神經元細胞且年齡在13天-15天時表現(xiàn)出對全麻藥物腦神經毒性作用最高的易感性。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R726.1

【參考文獻】

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1 楊炯炯,沈政;載人航天中微重力環(huán)境對認知功能的影響[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2003年06期

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本文編號：2313064