【摘要】：背景心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展的嚴(yán)重階段，及時(shí)手術(shù)治療是冠心病、心臟瓣膜病等所致心力衰竭患者延長生命、改善預(yù)后的關(guān)鍵，但這類患者更易發(fā)生圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI），給麻醉安全和患者生命都帶來嚴(yán)重威脅。本課題組發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的心肌保護(hù)措施缺氧預(yù)處理（Hypoxicpreconditioning, HPC）對(duì)心力衰竭心肌細(xì)胞缺氧再給氧損傷（Hypoxia-reoxygenationinjury, HR injury）的保護(hù)作用消失而嗎啡預(yù)處理（Morphine preconditioning, MPC）的保護(hù)作用仍存在，其機(jī)制尚待闡明。MicroRNA(miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類小分子非編碼RNA，參與調(diào)控心肌缺血再灌注損傷、缺血預(yù)處理的保護(hù)作用、心衰發(fā)展、阿片藥理作用等多個(gè)過程，但miRNA是否介導(dǎo)MPC保護(hù)心衰心肌細(xì)胞缺氧再給氧損傷目前尚未見報(bào)道。本研究利用微陣列分析技術(shù)探索MPC對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞microRNA (miRNA)表達(dá)譜的影響并預(yù)測(cè)分析miRNA的靶基因及其功能。 方法選擇健康成年雄性SD大鼠，尾靜脈注射阿霉素制備慢性心力衰竭模型，分離心室肌細(xì)胞，制備心肌細(xì)胞MPC及HR損傷模型，本課題實(shí)驗(yàn)分為兩部分完成。 實(shí)驗(yàn)一，miRNA芯片篩選。心室肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（nCON）、心衰對(duì)照組（fCON）、心衰嗎啡預(yù)處理組（fMPC）。各組處理后即刻收集細(xì)胞，提取總RNA行芯片分析檢測(cè)miRNA表達(dá)譜的變化，重點(diǎn)比較fCON和fMPC組間差異表達(dá)的miRNA；TargetScan、miRanda軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因，GO（基因功能）和KEGG Pathway（信號(hào)通路）分析靶基因功能，構(gòu)建miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，識(shí)別可能的核心miRNA及靶基因。實(shí)時(shí)定量PCR（quantitiverealtime PCR, qRT-PCR）法驗(yàn)證芯片結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)二，，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，選擇miR-133b-5p為目的miRNA，進(jìn)一步檢測(cè)其靶基因Fas在心衰心肌細(xì)胞HR損傷中的表達(dá)變化及預(yù)處理的干預(yù)作用。正常和心衰心肌細(xì)胞分離后，分為4組：正常對(duì)照組（nCON）、心衰對(duì)照組（fCON）、心衰缺氧再給氧組（fHR）、心衰嗎啡預(yù)處理組（fMPC+HR）。各組處理完畢后收集細(xì)胞提取RNA及蛋白，行qRT-PCR和Western blot檢測(cè)靶基因Fas mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 1. miRNA芯片分析結(jié)果miRNA芯片分析顯示，與nCON組比較，fCON組有5個(gè)miRNA上調(diào)7個(gè)miRNA下調(diào)；與fCON組比較，fMPC組有8個(gè)miRNA上調(diào)10個(gè)miRNA下調(diào)（p0.01，信號(hào)值500）。其中miR-133b-5p、miR-6216、miR-664-1-5p、let7e-5p等miRNA發(fā)生了顯著改變（Fold change2）。miR-133b-5p在心衰心肌細(xì)胞（fCON vs. nCON）中顯著下調(diào)，而經(jīng)MPC處理后miR-133b-5p表達(dá)水平增加（fMPC vs. fCON）；miR-6216，let7e-5p在心衰心肌細(xì)胞中均顯著上調(diào)，但經(jīng)MPC處理后表達(dá)水平降低。miR-664-1-5p在心衰過程中差異無顯著性，而fMPC處理后其表達(dá)顯著下調(diào)。 2.靶基因生物信息學(xué)分析GO及KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)fMPC誘導(dǎo)差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的靶基因主要與凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)、MAPK信號(hào)通路等功能有關(guān)。miRNA-gene-network發(fā)現(xiàn)miR-133b-5p及Fas可能是介導(dǎo)凋亡的核心miRNA和靶基因，并發(fā)現(xiàn)Fas的3’UTR區(qū)域含有miR-133b-5p的特異性結(jié)合位點(diǎn)。 3. qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示在nCON、fCON、fMPC三組中miR-133b-5p、miR-6216及l(fā)et7e-5p的表達(dá)水平和變化趨勢(shì)與miRNA芯片分析結(jié)果一致。 4. miR-133b-5p的靶基因Fas在心衰心肌細(xì)胞HR損傷中的表達(dá)及MPC的干預(yù)作用qRT-PCR結(jié)果顯示，與nCON組比較，fCON組Fas mRNA表達(dá)增加，與fCON比較，fHR組Fas mRNA表達(dá)下調(diào)，而fMPC+HR組較之fHR組則進(jìn)一步下調(diào)（p0.01）；Western blot結(jié)果顯示，與nCON組比較，fCON組Fas蛋白表達(dá)亦顯著增加，不同于mRNA表達(dá)，fHR組與fCON組比較Fas蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，而fMPC+HR組較之fHR組則降低（p0.01）。從各組Fas蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)，我們發(fā)現(xiàn)miR-133b-5p和Fas蛋白存在一種反向調(diào)節(jié)的關(guān)系。 結(jié)論MPC對(duì)心衰心肌細(xì)胞miRNA表達(dá)譜產(chǎn)生影響，其中miR-133b-5p、miR-6216、let7e-5p改變最為顯著；差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因功能主要集中于凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)以及MAPK信號(hào)通路；miR-133b-5p可能通過其靶基因Fas介導(dǎo)MPC對(duì)心力衰竭心肌細(xì)胞缺氧再給氧損傷的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R614

【參考文獻(xiàn)】

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2 王斌;張野;朱海娟;黃春霞;謝春林;吳運(yùn)香;胡憲文;陳志武;;瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)心力衰竭大鼠心肌的保護(hù)作用[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2012年07期

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本文編號(hào)：2285383