【摘要】：研究背景髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)是一群異質(zhì)性細(xì)胞,包括髓系祖細(xì)胞和未成熟的髓系細(xì)胞(immature myeloid cells, IMCs)。在健康人,IMCs在骨髓中產(chǎn)生,迅速分化為成熟的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。相對(duì)而言,在病理狀態(tài),比如腫瘤、各種感染性疾病、敗血癥、骨髓移植和某些自身免疫性疾病,IMCs分化為成熟髓系細(xì)胞受阻導(dǎo)致這群細(xì)胞大量擴(kuò)增。重要的是在病理狀態(tài)下IMCs的活化導(dǎo)致免疫抑制因子的表達(dá)上調(diào),比如精氨酸酶 1 (arginase 1,ARG1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及其產(chǎn)物一氧化氮(nitric oxide,NO)的增加和活性氧簇(reactive oxygen specicies,ROS)。在小鼠,MDSCs表達(dá)髓系細(xì)胞的標(biāo)記Gr-1(Ly6G和Ly6C)和CD11b。正常小鼠骨髓中包含50%～60%具有這群細(xì)胞表型的細(xì)胞,但在脾中只占到2%～5%。在人,MDSCs通常被定義為CD14-CD11b+,更嚴(yán)格地講,這群細(xì)胞表達(dá)了共同的髓系標(biāo)志CD33,而缺乏成熟的髓系和淋巴系細(xì)胞的標(biāo)志以及主要組織復(fù)合物II類分子人類白細(xì)胞抗原 DR (human leukocyte antigen DR, HLA-DR)。近來,根據(jù)Gr-1表達(dá)的不同,MDSCs形態(tài)上的異質(zhì)性在小鼠被更精確的定義:粒細(xì)胞MDSCs 具有 CD11b.4-Ly6G+Ly6Clow表型(G-MDSCs),而單核細(xì)胞 MDSCs 具有CD 1 1b+Ly6G-Ly6Chi 表型(M-MDSCs)。盡管MDSCs最初在腫瘤動(dòng)物模型和腫瘤患者中報(bào)道,隨著自身免疫性疾病的動(dòng)物模型的建立,MDSCs在自身免疫性疾病中的研究逐漸成為研究的焦點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)、炎癥性腸道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的小鼠模型中都有相關(guān)報(bào)道。而在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)及其動(dòng)物模型中卻鮮有研究。RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。在RA的發(fā)病過程中,持續(xù)性和進(jìn)展性的外周關(guān)節(jié)滑膜炎癥、血管翳形成,并出現(xiàn)骨和軟骨的破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。因此,阻止骨破壞成為治療RA的主要目標(biāo)之一。近年來,RA的治療取得顯著的進(jìn)展�！斑_(dá)標(biāo)治療”(treat-to-target)策略的提出,對(duì)RA的治療具有重要的指導(dǎo)意義。生物或非生物改善病情抗風(fēng)濕藥(modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs)在改善癥狀、長(zhǎng)期療效和 RA 患者生活質(zhì)量方面都有巨大進(jìn)步。但是,仍有許多患者遭受嚴(yán)重的骨破壞。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)模型是通過用Ⅱ型膠原(collagentypeⅡ,CⅡ)免疫大鼠(小鼠)誘導(dǎo)的多關(guān)節(jié)炎癥。主要特征表現(xiàn)為外周多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,后肢較前肢更易受累,無血管炎變現(xiàn),也無反復(fù)出現(xiàn)的關(guān)節(jié)癥狀。其發(fā)生機(jī)制是被CⅡ活化的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸入滑膜內(nèi)層,釋放炎癥因子,接著粒細(xì)胞等入浸,共同形成血管翳,破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)和膠原酶的作用導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)的喪失。該模型在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、病理組織學(xué)和免疫學(xué)等方面具有與人類RA有很多相似的特征,被認(rèn)為是目前研究RA的公認(rèn)動(dòng)物模型,較廣泛地用于RA發(fā)病機(jī)制以及治療RA的藥物研究。其中,兩者顯著的共同點(diǎn)之一是在滑膜組織中活化的OCs導(dǎo)致的關(guān)節(jié)破壞。OCs是具有骨吸收能力的多核巨細(xì)胞。在正常情況下,OCs的生成和骨成型主要發(fā)生在骨髓腔內(nèi)。破骨細(xì)胞前體(osteoclast precursors,OCPs)起源于骨髓造血干細(xì)胞。受到多種因素影響的造血干細(xì)胞分為:共同的淋巴樣祖細(xì)胞和共同的髓樣祖細(xì)胞。共同的淋巴樣祖細(xì)胞生成T、B淋巴細(xì)胞以及自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞。B220+前B細(xì)胞有形成OCs的能力,成熟的T、B淋巴細(xì)胞不能形成OCs,但是可以通過產(chǎn)生核因子-κB受體激活配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)或骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)間接影響OCs生成。來源于RA患者滑液的NK細(xì)胞誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分化為OCs。共同的髓樣祖細(xì)胞生成巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞和粒/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞。成克隆實(shí)驗(yàn)表明巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞祖細(xì)胞不能產(chǎn)生粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落形成單位(colony-forming units for granulocytes and macrophage,CFU-GMs),意味著它們沒有形成OCs的潛能。像T、B淋巴細(xì)胞一樣,巨核細(xì)胞通過產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)和血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)間接調(diào)控OCs形成。粒/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為成熟的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和OCs。在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和RANKL的作用下,巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞又分化為OCs。前期的研究結(jié)果表明在CIA小鼠外周血、脾細(xì)胞及骨髓MDSCs細(xì)胞比例增加,在小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中也發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞的聚集,且這群細(xì)胞比例的增加與小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分呈正相關(guān)。那么,在大量擴(kuò)增的這群細(xì)胞是如何影響CIA的病情呢?同時(shí)考慮到,MDSCs可以分化巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞做為OCPs,可以在M-CSF和RANKL的作用下誘導(dǎo)分化為OCs,據(jù)此,我們推測(cè)MDSCs可能誘導(dǎo)分化為OCs。MDSCs在免疫微環(huán)境中扮演著重要的角色,針對(duì)MDSCs分化中的各個(gè)環(huán)節(jié)以及對(duì)其功能的研究也日趨清晰,靶向MDSCs的治療方法也在不斷進(jìn)展,大致可分為4個(gè)方面:促進(jìn)MDSCs分化、抑制MDSCs成熟、阻止MDSCs在外周器官的聚集及調(diào)控MDSCs發(fā)揮抑制功能的分子。IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子以及 MMP-9 調(diào)控著 MDSCs 成熟。另外,環(huán)氧化酶-2 (cyclooxygenase 2,COX-2)是一個(gè)重要的調(diào)控MDSCs抑制功能的靶點(diǎn)。RA屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹病”或“痹證”范疇。最早記載于《內(nèi)經(jīng)》,稱之為“痹”�！端貑枴け哉摗费浴八^痹者,各以其時(shí)重感于風(fēng)寒濕之氣也”,又言“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹也。風(fēng)氣盛者為行痹,寒氣盛者為痛痹,濕氣盛者為著痹”......痹證以祛風(fēng)通絡(luò)為治療大法,治以祛風(fēng)、除濕、散寒、舒經(jīng)活絡(luò),病程日久者配合補(bǔ)益之法。青藤堿(sinomenine,SIN)是從中藥清風(fēng)藤中提取的單體生物堿,具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等多種藥理作用。清風(fēng)藤開始應(yīng)用于風(fēng)濕性疾病的治療已有1000多年的歷史。SIN可通過影響成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)代謝周期、增殖和凋亡等幾方面調(diào)控著滑膜炎癥;抑制樹突狀細(xì)胞活性、表面分子和趨化因子的表達(dá);抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和COX-2釋放。因此,我們推測(cè),SIN可能通過抑制IL-1β、IL-6、COX-2等的表達(dá),而抑制MDSCs的成熟以及功能發(fā)揮。研究目的1.在CIA小鼠模型中,探索MDSCs與CⅠA發(fā)病可能的機(jī)制;2.體外誘導(dǎo)MDSCs分化為OCs,探討MDSCs與CⅠA骨破壞的關(guān)系;3.研究青藤堿對(duì)MDSCs的影響,進(jìn)一步證實(shí)MDSCs在CⅠA骨破壞中重要作用。方法1.MDSCs在CIA小鼠中的比例、表型及抑制功能研究C57BL/6(H-2b)小鼠60只,雄性,8～10周齡。CⅡ溶解于10mM的乙酸,濃度為2mg/ml,攪拌,4℃過夜充分溶解。將溶解的CⅡ與CFA等體積混合,冰浴中使用勻漿器充分乳化。使用帶有26G針頭1ml注射器吸取CⅡ/CFA乳劑,于小鼠尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射100ul乳劑。初次免疫后第14天后,將CⅡ/IFA等體積混合乳化,100ul每只,避開初次免疫部位進(jìn)行加強(qiáng)免疫。初次免疫后每周3次記錄小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分。觀察結(jié)束后,乙醚麻醉后脫臼處死小鼠,收集小鼠雙側(cè)后肢,常規(guī)脫鈣,隨后進(jìn)行關(guān)節(jié)滑膜組織的固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片以及HE染色。免疫4周后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血(peripheral blood,PB)、脾細(xì)胞(splenocytes,SP)、骨髓(bone marrow, BM)MDSCs及亞群水平;免疫熒光檢測(cè)小鼠關(guān)節(jié)滑膜Gr-1+細(xì)胞的浸潤(rùn);免疫磁珠及流式細(xì)胞術(shù)分選MDSCs及其亞群G-MDSCs和M-MDSCs; 3H-TdR檢測(cè)MDSCs、G-MDSCs和M-MDSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的影響;ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN--γ水平。2.MDSCs分化為OCs的研究C57BL/6小鼠用C@/CFA免疫4周,免疫磁珠分選未免疫和CIA小鼠脾MDSCs,400μl體系接種2×105細(xì)胞到培養(yǎng)小室,20ng/ml的M-CSF刺激3天,隨后20ng/ml M-CSF和100ng/ml RANKL培養(yǎng)6天,結(jié)束后,進(jìn)行細(xì)胞固定以及TRAP染色。C57BL/6小鼠用CⅡ/CFA免疫4周,流式細(xì)胞術(shù)分選CIA小鼠脾MDSCs亞群G-MDSCs和M-MDSCs。用上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),結(jié)束后,進(jìn)行細(xì)胞固定以及TRAP染色。2×104MDSCs、M-MDSCs和G-MDSCs接種于96孔 Osteo Assay surface plate,培養(yǎng)體系為400μl α-MEM(含 10%FBS); 20ng/ml M-CSF刺激3天,隨后用20ng/ml M-CSF和100ng/mlRANKL培養(yǎng)6天,吸走培養(yǎng)液,加入100ul/孔10%漂白劑移除細(xì)胞,室溫空氣干燥;在顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取6個(gè)視野拍攝照片,采用NIS-Elements軟件進(jìn)行圖像分析,計(jì)算并比較各組陷窩面積。3.青藤堿對(duì)CIA小鼠MDSCs的干預(yù)研究C57BL/6(H-2b)小鼠,雄性,8～10周齡。CⅡ/CFA乳劑誘導(dǎo)CIA模型,初次免疫后第14天后,將CⅡ/IFA等體積混合乳化,行加強(qiáng)免疫一次。分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組于初次免疫后的第35d每日給予SIN100mg/kg灌胃,對(duì)照組給予PBS,至觀察結(jié)束。初次免疫后每周3次記錄小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分。觀察結(jié)束后,乙醚麻醉后脫臼處死小鼠,收集小鼠雙側(cè)后肢,常規(guī)脫鈣,隨后進(jìn)行關(guān)節(jié)滑膜組織的固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片以及HE染色。對(duì)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、軟骨的破壞和骨侵蝕三方面進(jìn)行關(guān)節(jié)滑膜病理評(píng)分。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠 PB 和 SP MDSCs 及 SP G-MDSCs 和 M-MDSCs 水平�？诜� SIN 或 PBS后收集 CIA 小鼠脾,RT-PCR 檢測(cè) IL-1β,IL-6, COX-2, TRAP,CTR 和 MMP-9 mRNA表達(dá)。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)(x±s)表示。正態(tài)分布計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量的方差分析,組間多重比較采用Bonferroni或Dunnett's T3法,顯著性水平α =0.05,以雙側(cè)P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1. MDSCs在CIA小鼠中的比例、表型及抑制功能研究1.1 CIA模型的鑒定及評(píng)價(jià)小鼠初次免疫后18天出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅或腫脹,首發(fā)多為趾間關(guān)節(jié),隨后蔓延至足皮墊、踝關(guān)節(jié)。初次免疫后28天紅腫及多關(guān)節(jié)炎病變達(dá)高峰,觀察到第50天時(shí)發(fā)生率為60%,對(duì)照組小鼠無關(guān)節(jié)炎改變。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示:正常小鼠滑膜組織排列規(guī)則,未見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞的浸潤(rùn),軟骨及骨的破壞;模型組小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織重度增生,滑膜層變厚,大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),軟骨及骨的破壞。1.2 MDSCs及亞群G-MDSCs和M-MDSCs在CIA小鼠聚集誘導(dǎo)4周后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠PB、SP和BM MDSCs水平,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,CIA小鼠PB、SP和BM MDSCs水平顯著升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-18.77、-9.48 和-8.48, P均0.001)。誘導(dǎo)4周后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠SPMDSCs亞群水平,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,CIA小鼠SPG-MDSCs和M-MDSCs水平均顯著升高,差異具均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.18和-4.90,P均0.05)。分別在 0d、7d、14d、21d、28d、35d 和 42d 動(dòng)態(tài)分析 CIA 小鼠 PB CD11b+Gr-1+MDSCs變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD11b+Gr-1+MDSCs的比例隨發(fā)病天數(shù)增加呈上升趨勢(shì),CD11b+Gr-1+MDSCs的比例在第28天達(dá)到峰值(43.34±4.30) %,第35天左右開始減低(36.59±8.31) %。隨后用免疫熒光檢測(cè)了關(guān)節(jié)Gr-1+細(xì)胞的募集,發(fā)現(xiàn)大量Gr-1+細(xì)胞浸潤(rùn)到CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜,然而,對(duì)照組小鼠關(guān)節(jié)未見Gr-1+細(xì)胞。1.3CIA進(jìn)展過程中MDSCs的表型特征免疫4周后,流式細(xì)胞術(shù)分析SP MDSCs表型特征,結(jié)果顯示對(duì)照組及CIA小鼠 CD11b+Gr-1+MDSCs 均不表達(dá) CD11c、MHC-Ⅱ、F4/80 和 CD80,而表達(dá)CD115、CCR2 和 CD62L。更有意思的是對(duì)照組及CIA小鼠PB、SP和BM CD11b+Gr-1+ MDSCs表達(dá)了OCs 的特異性標(biāo)記 CD51,并且 CIA 小鼠 PB、SP 和 BM CD11b+Gr-1+ MDSCs表達(dá)更高水平的 CD51 (60.61% vs 72.24%, 29.30% vs 38.80%, 52.66% vs 58.84%)。1.4 CIA小鼠MDSCs抑制由CD3/CD28共刺激的T細(xì)胞的活化1.4.1 MDSCs及亞群影響T細(xì)胞增殖未免疫的脾細(xì)胞用CD3和CD28mAb刺激后與不同比例的脾CD11b+Gr-1+MDSCs共培72小時(shí),3H-TdR摻入檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果表明:經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差不齊,F=3.84,P=0.039。近似F檢驗(yàn)Welch法顯示F=323.41,v=3,P=0.000,多重比較結(jié)果顯示:(MDSCs:Splenocytes)為(1:2)組與不加MDSCs組相比,顯著抑制T細(xì)胞增殖(P=0.001)。同樣,(MDSCs:Splenocytes)為(1:1)組與不加MDSCs組相比,也顯著抑制T細(xì)胞增殖(P=0.000)。未免疫的脾細(xì)胞用CD3和CD28 mAb刺激后與不同比例的G-MDSCs共培72小時(shí),3H-TdR摻入檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果表明:經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差不齊,F=5.127,P=0.016。近似F檢驗(yàn)Welch法顯示F=1382.751,v=3, P=0.000,多重比較結(jié)果顯示:(G-MDSCs:Splenocytes)即(1:2)和(1:1)組與不加G-MDSCs組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074和P=0.092)。未免疫的脾細(xì)胞用CD3和CD28 mAb刺激后與不同比例的脾M-MDSCs共培72小時(shí),3H-TdR摻入檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果表明:經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差不齊,F=7.042, P=0.005。近似 F 檢驗(yàn) Welch 法顯示F=1382.751,v=3,P=0.000,多重比較結(jié)果顯示:(M-MDSCs:Splenocytes)為(1:2)組與不加MDSCs組相比,顯著抑制T細(xì)胞增殖(P=0.000)。而(MDSCs:Splenocytes)為(1:1)組與不加M-MDSCs組相比,也同樣顯著抑制T細(xì)胞增殖(P=0.000)。1.4.2細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-y水平未免疫的脾細(xì)胞用CD3和CD28 mAb刺激后與不同比例的脾MDSCs共培56小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)IFN-γ水平。結(jié)果顯示:經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差不齊,F=3.491,P=0.05。近似F檢驗(yàn)Welch法顯示F=1832.78, v=3, P=0.000,多重比較結(jié)果顯示:(MDSCs:Splenocytes)為(1:2)組與不加MDSCs組相比,IFN-γ水平顯著降低(P=0.000)。同樣,(MDSCs:Splenocytes)為(1:1)組與不加MDSCs組相比,IFN-γ水平顯著降低(P=0.000)。未免疫的脾細(xì)胞用CD3和CD28 mAb刺激后與不同比例的脾G-MDSCs共培56小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)IFN-γ水平。結(jié)果顯示:經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差不齊,F=12.586, P=0.001。近似 F 檢驗(yàn) Welch 法顯示 F=26188.37, v=3, P=0.000,多重比較結(jié)果顯示:(G-MDSCs:Splenocytes)即(1:2)和(1:1)組與不加G-MDSCs組相比,IFN-γ水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.115和P=0.795)。未免疫的脾細(xì)胞用CD3和CD28 mAb刺激后與不同比例的脾M-MDSCs共培56小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)IFN-γ水平。結(jié)果顯示:經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差不齊,F=11.444, P=0.001。近似F檢驗(yàn)Welch法顯示F=8320.55, v=3,P=0.000,多重比較結(jié)果顯示:(M-MDSCs:Splenocytes)為(1:2)組與不加 M-MDSCs組相比,IFN-γ 水平顯著降低(P=0.000)。且(MDSCs:Splenocytes)為(1:1)組與不加MDSCs組相比,IFN-γ水平也顯著降低(P=0.000)。2.MDSCs分化為OCs的研究2.1 體外誘導(dǎo) CD11b+Gr-1+ MDSCs 分化為 OCsTRAP染色后,光鏡下觀察可見,OCs體積較大,形態(tài)不規(guī)則,胞漿呈酒紅色不均勻沉淀,可見大量圓形嗜酸性顆粒,胞核數(shù)量多。經(jīng)過蘇木素復(fù)染,胞核則呈深黑色。CIA小鼠CD11b+Gr-1+MDSCs誘導(dǎo)分化為OCs細(xì)胞數(shù)(27.00±2.00)顯著高于對(duì)照組(8.33±1.53),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.85, P=0.000)。2.2體外誘導(dǎo)MDSCs亞群G-MDSCs和M-MDSCs分化為OCs免疫4周,流式細(xì)胞術(shù)分選CIA小鼠脾G-MDSCs和M-MDSCs,用上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行TRAP染色,結(jié)果表明CIA小鼠M-MDSCs誘導(dǎo)分化為OCs(13.00±1.00)/視野,而G-MDSCs未見OCs分化。流式細(xì)胞術(shù)分選CIA小鼠脾 G-MDSCs 和 M-MDSCs 純度分別為 99.2%、98.6%。2.3骨吸收陷窩檢測(cè)隨后,分析MDSCs、G-MDSCs和M-MDSCs是否能分化為功能性的OCs,MDSCs、G-MDSCs和M-MDSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后,去除細(xì)胞,空氣干燥后,顯微鏡下觀察骨吸收陷窩面積,發(fā)現(xiàn)CIA小鼠MDSCs骨吸收陷窩面積高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.99, P=0.003)。CIA小鼠G-MDSCs組未見骨吸收陷窩,而M-MDSCs組可觀察到大量骨吸收陷窩。3.青藤堿對(duì)CIA小鼠MDSCs的干預(yù)研究3.1 SIN 干預(yù)后 CIA 小鼠 PB、SP MDSCs 水平及 SP G-MDSCs 和 M-MDSCs 水平與對(duì)照組相比,SIN干預(yù)后PB、SP MDSCs水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( =9.87 和 4.23,P0.001 和 0.05)。SIN干預(yù)后SP G-MDSCs水平與對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.40,P0.05)。而SP M-MDSCs水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.24, P0.05)。3.2SIN對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥及骨破壞的影響3.2.1 SIN對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分影響造模后約d21出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀,后足首先出現(xiàn)紅腫,初次免疫后35天紅腫及多關(guān)節(jié)炎病變達(dá)高峰。于初次免疫后的第35天每日給予SIN100mg/kg灌胃,至觀察結(jié)束。d35和d38時(shí),SIN干預(yù)組與對(duì)照組相比,關(guān)節(jié)炎評(píng)分無差異(P=0.90和P=0.16); d41時(shí),與對(duì)照組相比,SIN干預(yù)組顯著降低關(guān)節(jié)炎評(píng)分(P=0.01)。SIN干預(yù)組,d35與d38、d38與d41之間關(guān)節(jié)炎評(píng)分無差異(P=0.51和P:=0.10),而d35與d41之間關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低(P=0.04)。本資料滿足球形假設(shè),W=0.939,P=0.754。重復(fù)因素3個(gè)不同水平間差異有顯著性意義(P0.001),時(shí)間和分組之間存在交互作用(P=0.001)。多重比較的結(jié)果表明:d35與d38,關(guān)節(jié)炎評(píng)分無顯著性差異(P=0.063); d35與d41、d38與d41之間關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低(P=0.000、0.004)。3.2.2 SIN對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)病理的影響SIN干預(yù)后,顯著降低關(guān)節(jié)病理評(píng)分,關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、軟骨破壞及骨侵蝕改善均優(yōu)于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.80、5.58和6.33,P均0.05)。3.3 SIN干預(yù)后IL-1β、IL-6、(COX-2、TTRAP、CTR和MMP-9mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比,SIN干預(yù)后,脾細(xì)胞IL-1β、IL-6、COX-2、TRAP、CTR和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平均下降。結(jié)論1 .CIA小鼠體內(nèi)大量聚集的CD1 1b+Gr-1+MDSCs及亞群G-MDSCs(CD11b+tLy6G+Ly6Clow)和M-MDSCs(DD11b+Ly6G-LG6IChi)可能參與了其發(fā)病過程。2.SPMDSCs不表達(dá)F4/80、CD80、CD11c和MHC-Ⅱ,表明這群細(xì)胞是非成熟的或未分化的髓系細(xì)胞;然而表達(dá)了炎癥性單核細(xì)胞的標(biāo)記,如CD1115、CCR2和 CD62L。3.CIA小鼠PB、SP和BM CD11b+Gr-1+ MDSCs表達(dá)更高水平的CD51,提示CIA小鼠體內(nèi)CD11b+Gr-1+MDSCs可能是一個(gè)新的OCPs。4.MDSCs和M-MDSCs均可抑制T細(xì)胞的增殖,降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平,提示CIA小鼠MDSCs具有免疫抑制功能,而對(duì)T細(xì)胞的抑制功能不足,可能影響CIA的發(fā)病。5.MDSCs特別是M-MDSCs在體外可誘導(dǎo)分化為功能性的OCs,證實(shí)了 OCs新的來源。6.SIN可能通過減少M(fèi)DSCs及亞群M-MDSCs的聚集,進(jìn)而減輕CIA的嚴(yán)重程度。7.SIN 可能通過降低 IL-1β、IL-6、COX-2 和 MMP-9、CTR 和 TRAP mRNA 的表達(dá),減少M(fèi)DSCs及亞群M-MDSCs的富集,從而減少OCs的形成,減輕CIA骨破壞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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3 孫s，

本文編號(hào)：2258885