發(fā)布時間：2018-09-10 13:01

【摘要】：研究目的:各種損傷因素所導(dǎo)致的急慢性皮膚創(chuàng)傷是臨床最常見的疾患之一。創(chuàng)傷治療的目的是清創(chuàng)后采用有效手段促進(jìn)創(chuàng)面盡快愈合,恢復(fù)受損組織的功能。已知,創(chuàng)面愈合是皮膚受損組織通過十分復(fù)雜但又有序的自我修復(fù)機制使整個創(chuàng)面恢復(fù)原貌的過程。研究表明,皮膚損傷修復(fù)過程不但存在皮膚內(nèi)各細(xì)胞組分的增殖還有賴于一系列緊密聯(lián)系的生化和分子生物學(xué)的級聯(lián)反應(yīng)。這些分子機制逐一和遞次地出現(xiàn)在皮膚損傷修復(fù)的四個階段,即止血,炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖和塑形,最終實現(xiàn)皮膚創(chuàng)面如期修復(fù)愈合;換言之,正是損傷修復(fù)相關(guān)因子推動了損傷修復(fù)的進(jìn)程。因此,深入認(rèn)識損傷修復(fù)的分子機制,進(jìn)而采取有效的治療手段調(diào)節(jié)修復(fù)促進(jìn)因子的表達(dá)和產(chǎn)生具有重要的理論價值和臨床意義。同時,對損傷修復(fù)促進(jìn)因子(因素)的上調(diào)作用正在成為評價創(chuàng)傷治療效果的重要指標(biāo)。長期的臨床實踐證實,將醫(yī)用絲光綠蠅蛆蟲(簡稱五谷蟲)放置于創(chuàng)面表面可以對創(chuàng)面起到祛腐清創(chuàng)的作用。這一治療方法尤其適用于感染及壞死較為嚴(yán)重的慢性創(chuàng)面和潰瘍的治療。盡管五谷蟲具有吞噬和去除污染及感染組織的作用,但由于主客觀的原因并非所有患者都能夠接受這種治療方法;另外,蛆蟲短暫的成熟期使它們很快變蛹失去效用。近期研究發(fā)現(xiàn),五谷蟲促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用不僅是通過吞噬感染組織,其分泌和排泄物中也含有一些有益于抗菌和促進(jìn)細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),五谷蟲蟲體本身具有很強的自我修復(fù)能力,從而進(jìn)一步說明五谷蟲蟲體細(xì)胞中含有促損傷修復(fù)的細(xì)胞因子/生長因子,借助有效生物技術(shù)提取的蟲體蛋白有可能是治療皮膚創(chuàng)傷尤其是慢性損傷和不愈合創(chuàng)面的潛在生物制劑。不過,目前有關(guān)這方面的研究還鮮見報道。如前所述,損傷修復(fù)有賴于皮膚組織中各細(xì)胞組分的分裂、增殖、游走和新生血管形成,而這些細(xì)胞分子生物學(xué)現(xiàn)象受到某些生長因子的調(diào)控。這些生長因子以協(xié)調(diào)和互補的方式共同促進(jìn)損傷愈合的進(jìn)程,它們包括表皮生長因子/EGF,轉(zhuǎn)化生長因子/TGF家族蛋白,成纖維細(xì)胞生長因子/FGF,肝細(xì)胞生長因子/HGF和血小板衍生生長因子/PDGF等。進(jìn)一步的研究表明,這些因子作為分子信號主要通過特定的或由其它蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi),通過調(diào)節(jié)諸如c-Myc,Bcl-2,survivin,cyclin D1和VEGF等基因的表達(dá)發(fā)揮其損傷修復(fù)促進(jìn)作用。大量研究證實,Wnt,STAT3,TGF-beta-Smad2/3,NF-kB和Notch等信號通路參與了損傷修復(fù)和組織再生的過程。盡管五谷蟲及其提取物的促損傷修復(fù)的效果得到證實,但其作用的分子機制尤其是對上述生長因子,信號通路以及通路下游基因表達(dá)的影響迄今尚無報道。闡明上述問題將為五谷蟲制劑的實際應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù),因此成為本課題的研究目的。五谷蟲本身,其分泌/排泄物以及蟲體提取物都有一定的損傷修復(fù)促進(jìn)作用,但目前還不清楚哪些組分發(fā)揮更大的作用。因此,在相同的動物體內(nèi)和體外實驗條件下觀察這些組分的促進(jìn)損傷修復(fù)的功效以及它們對損傷修復(fù)相關(guān)因子/信號通路的影響能夠科學(xué)地回答這個問題,也有助于五谷蟲提取物的合理使用與配制。這也成為本博士論文的另一個立題依據(jù)。材料與方法一.五谷蟲樣品制備:蛆蟲分泌/排泄物:蛆蟲經(jīng)常規(guī)處理后收集。20克冰凍蛆體,切成薄片,總蛋白提取,實驗動物共設(shè)4組(8只/組):組1:凡士林軟膏涂抹;組2:分泌/排泄物(Secretion/excretion;S/E);組3:吐后蛆體裂解液(Extract+S/E);組4:未吐蛆體裂解液處理(Extract-S/E)。二.體內(nèi)實驗部分:1.動物選擇與飼養(yǎng)條件:取健康成年雄性SD大鼠32只,隨機分成4組(8只/組)。飼養(yǎng)于25℃,相對濕度為40%~70%環(huán)境下,每天接受自然光照9小時,由飲食飲水。2.損傷模型的建立:麻醉藥腹內(nèi)注射麻醉后,去毛劑脫毛;無菌下在背部造成2個直徑為1.5cm的圓形全層皮膚開放創(chuàng)面。造模動物不用抗生素及抗凝劑。3.愈合情況觀察:于造模后第1、3、5、7、9、12、14和16天觀察創(chuàng)面的色澤、腫脹程度、表面滲液、肉芽組織生長和表皮增生修復(fù)情況。用透明膜創(chuàng)面記錄表描畫創(chuàng)面外緣。4.創(chuàng)面愈合的測定方法:根據(jù)透明膜上描記的創(chuàng)面外緣,利用photo shop軟件計算創(chuàng)面面積及愈合百分率:面積測算公式:面積=圈內(nèi)灰度值/標(biāo)準(zhǔn)面積單位灰度值;創(chuàng)面愈合百分率:愈合率=所測面積/初始面積X 100%。5.創(chuàng)面取材和組織學(xué)觀察:在上述觀測期,取各創(chuàng)面0.2X0.4cm全層邊緣健康組織,分別做做冰凍切片/蛋白提取和石蠟包埋組織H/E組織形態(tài)學(xué)染色。顯微鏡下觀察組織中各細(xì)胞成分的生長情況、有無壞死。這些組織還將用于細(xì)胞和分子生物學(xué)分析。根據(jù)上述觀察,評估各處理方式促進(jìn)愈合的效果。三.體外實驗:1.細(xì)胞培養(yǎng):Ha Cat人角質(zhì)細(xì)胞系;原代培養(yǎng)的人正常成纖維細(xì)胞系;2.五谷蟲提取物:1空腹五谷蟲組(蟲體組);2含分泌物五谷蟲組;3分泌物組。3.提取物濃度:200mg/ml,150mg/ml和100mg/ml;4.觀察時間:72小時5.實驗方法:MTT細(xì)胞增殖活性測定;劃痕損傷實驗;RNA提取和RT-PCR;蛋白提取和Western印跡分析。結(jié)果第一部分三種五谷蟲提取物的制備及產(chǎn)出量和質(zhì)量分析出不含五谷蟲分泌物/排泄物的五谷蟲蟲體組(20克),含分泌物/排泄物的五谷蟲蟲體組(20克)和由20克五谷蟲分泌和排泄的混合物中的蛋白濃度,它們的含量分別是89.85mg(5.99mg/ml;5990mg/ml),88.05 mg(5.87mg/ml;5870mg/ml)和9 mg(0.6mg/ml;600mg/ml)。1.五谷蟲提取物的制備量和濃度:使用280nm的紫外分光光度計測出OD值,計算2.五谷蟲提取物組成成分分析:10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示:兩組蟲體提取物所含蛋白的分子量大小范圍從7 k Da到210 k Da,蛋白譜型基本一致,蛋白的條帶清晰,無拖尾降解現(xiàn)象但分泌/排泄后蟲體提取物的蛋白條帶略弱一些;分泌物/排泄物混合物未見大分子蛋白,條帶的分子量小于7 k Da。3.采用新方法制備五谷蟲提取物縮短了制備時間:采用本文介紹的方法可在不到5分鐘即可完成五谷蟲粗提物的制備且操作過程十分簡捷。4.高濃度五谷蟲分泌的收集:采用本文收集方法可獲得濃度為600mg/ml甚至更高的混合物,使不經(jīng)濃縮甚至需稀釋后用于體內(nèi)和體外實驗成為可能。第二部分改良的透明膜測量法在計算大鼠皮膚損傷愈合率中的應(yīng)用1.高通量的信息采集:按觀測不同的時間,組別和大鼠編號將所測創(chuàng)面簡潔、整齊和有序的(一個創(chuàng)面的不同觀察日標(biāo)記信息 圈套圈‖的形式)集成到本課題設(shè)計的一張長方形透明膜上。由于實驗?zāi)┢诘囊恍⿲嶒灲M的創(chuàng)面提前愈合,所以在整個實驗過程中總共在一張透明膜上記錄和收集了243個而非256個創(chuàng)面邊緣描記圖像。而傳統(tǒng)的透明膜測量方法是按預(yù)計觀測次數(shù)與創(chuàng)面數(shù)量準(zhǔn)備足夠數(shù)量的整張面積大于造模面積的正方形透明膜,并在每張透明膜上標(biāo)明觀測時間,組別和大鼠序號。因此,信息采集過程十分繁瑣、費時和凌亂。2.透明膜標(biāo)記信息的精確和高效處理:將含有243個創(chuàng)面邊緣描記圖像的透明膜經(jīng)掃描儀掃描入電腦并保存后,利用Adobe Photoshop CS4 site圖像分析軟件工具欄中磁性套圈選項描記創(chuàng)面邊緣,點擊直方圖項(圖2C)查看創(chuàng)面像素值,并將像素值填在excel表中,對每個標(biāo)記信息的測量平均用時在27秒以內(nèi)。因此,在2小時之內(nèi)便可獲得所有觀測日包(括首日)全部243個創(chuàng)面的像素值和面積。3.改良透明膜測量法有很高的機動性:根據(jù)創(chuàng)面隨時間推移而逐漸變小的特點,透明膜模板內(nèi)附有四個標(biāo)準(zhǔn)面積單位作為計算標(biāo)準(zhǔn)尺,所以可根據(jù)所需測量創(chuàng)面的大小選擇面積合適的計量單位或用同一個計量單位的像素值進(jìn)行所有創(chuàng)面的面積換算。4.未經(jīng)分泌/排泄的五谷蟲蟲體提取物有更強的損傷修復(fù)促進(jìn)作用:對4個實驗組8個時間點的243個采集信息的像素/面積換算的結(jié)果表明,與只有凡士林處理的創(chuàng)面相比,三種五谷蟲提取物均有損傷修復(fù)促進(jìn)作用(P0.05)且以150mg/ml未經(jīng)分泌/排泄的五谷蟲蟲體提取物的實驗組創(chuàng)面愈合的速度更快,該組內(nèi)的所有創(chuàng)面在實驗第14或第16天全部愈合。5.Ki-67陽性細(xì)胞標(biāo)記率的差異:Ki-67由G1和S期細(xì)胞產(chǎn)生,因此是反映細(xì)胞增殖活性的生物標(biāo)記物。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示,含分泌/排泄物和不含分泌/排泄物的五谷蟲蟲體提取物處理創(chuàng)面內(nèi)的Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯高于凡士林涂抹組創(chuàng)面,進(jìn)一步提示兩種提取物具有細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。第三部分五谷蟲提取物促進(jìn)人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖1.中低濃度五谷蟲提取物的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用:使用最終濃度為150mg/ml和100mg/ml的含分泌/排泄物(Extract+S/E)和不含分泌/排泄物(Extract-S/E)的五谷蟲蟲體提取物處理人永生化角質(zhì)細(xì)胞Ha Cat和10代以內(nèi)的成纖維細(xì)胞。H/E染色和MTT的檢測結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞被100mg/ml和150mg/ml的Extract+S/E和Extract-S/E處理后細(xì)胞數(shù)目明顯增加,增殖活躍。2.高濃度五谷蟲提取物具有細(xì)胞毒性:當(dāng)使用200mg/ml的Extract+S/E和Extract-S/E處理Ha Cat和成纖維細(xì)胞后,兩種細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象,MTT的OD值明顯降低,提示五谷蟲提取物作為生物活性物質(zhì)在高濃度下有較強的細(xì)胞毒作用。第四部分五谷蟲提取物促進(jìn)體內(nèi)和體外皮膚損傷修復(fù)的分子機制1.五谷蟲提取物處理組織中沒有發(fā)現(xiàn)NF-kB亞單位p65的核易位,即NF-kB處于不活化狀態(tài);2.Wnt2在創(chuàng)面組織內(nèi)表達(dá)但b-catenin分布在胞漿尤其是膜表面,未見核易位,提示W(wǎng)nt2/b-catenin通路沒有活化;3.受損組織內(nèi)Notch1表達(dá)水平較低且其下游基因Hes1罕見核易位,故該通路的活性很低;4.基于組織芯片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,五谷蟲提取物能明顯上調(diào)TGF-b/Smad3和STAT3的表達(dá);在胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均可檢測到磷酸化STAT3,因此這兩個通路在五谷蟲提取物處理組織內(nèi)的活化程度明顯提高。5.對五谷蟲提取物處理的角質(zhì)和成纖維細(xì)胞的檢測結(jié)果與創(chuàng)面組織的結(jié)果相似,即處理后的兩種細(xì)胞內(nèi),TGF-b/Smad3和STAT3信號通路的活性明顯增強而其它幾個被測通路的活化狀態(tài)在提取物處理前后變化不大。6.五谷蟲提取物對損傷修復(fù)相關(guān)基因的上調(diào)作用:來自體外培養(yǎng)的兩種細(xì)胞和組織芯片的檢測結(jié)果顯示,五谷蟲提取物能明顯上調(diào)創(chuàng)面組織,角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)c-Myc,cyclin D1 and VEGF的表達(dá),且以Extract+S/E處理組更為明顯。而Notch的下游基因Hes1和NF-kB的靶基因COX-2則變化不顯著,提示五谷蟲提取物不影響Notch和NF-kB信號通路的活化狀態(tài)。7.五谷蟲提取物處理組織內(nèi)CD68-陽性細(xì)胞明顯減少:CD68-陽性細(xì)胞的多少反映受損創(chuàng)面的炎性反應(yīng)程度。檢測發(fā)現(xiàn),未處理組的第3和第7天創(chuàng)面組織內(nèi)存在少量CD68-陽性細(xì)胞(5-8細(xì)胞/視野;X20),而提取物處理組的組織內(nèi)則極少見到(2細(xì)胞/視野;X20)甚至沒有見到CD68-陽性細(xì)胞。這說明,實驗過程中皮膚創(chuàng)面處于無感染狀態(tài),五谷蟲提取物能進(jìn)一步降低炎性反應(yīng)的程度。結(jié)論1.采用本課題組獨特的蛋白提取和分泌/排泄物收集方法,高產(chǎn)出,高質(zhì)量地制備出三種五谷蟲提取物,為下一步的實驗研究提供了可靠的保證。2.建立和完善了透明膜創(chuàng)面面積標(biāo)記和測量法并在精確計算大鼠皮膚損傷愈合率中應(yīng)用,獲得了可靠的數(shù)據(jù),取得了更為精確的測量結(jié)果。3.基于透明膜創(chuàng)面面積標(biāo)記和測量法的檢測結(jié)果顯示,含有分泌/排泄的,分泌/排泄后的五谷蟲蟲體提取物以及分泌/排泄混合物對大鼠皮膚損傷均有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用且前者的作用更為明顯。這提示,在五谷蟲蟲體及其分泌/排泄混合物中都含有損傷修復(fù)促進(jìn)因子。因此,在實踐中使用未經(jīng)分泌/排泄的蟲體提取物可能取得更好的治療效果。4.中低濃度的五谷蟲提取物對人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,但濃度較高時則抑制細(xì)胞生長甚至具有殺傷性。這種現(xiàn)象表明,五谷蟲提取物具有較強生物活性,因此在使用前應(yīng)該掌握其最佳使用濃度,以避免可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。5.對僅用凡士林處理和五谷蟲提取物處理創(chuàng)面的檢測結(jié)果顯示,提取物處理對創(chuàng)面組織內(nèi)NF-?B,Wnt2/?-catenin和Notch通路的狀態(tài)無明顯影響,說明這三個通路未必是提取物作用的對象;換言之,后者對修復(fù)的促進(jìn)作用不是借助這三個通路來實現(xiàn)。6.TGF-?/Smad3通路是公認(rèn)的損傷修復(fù)促進(jìn)因素而STAT3通路的活化能夠上調(diào)一系列細(xì)胞增殖促進(jìn)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,五谷蟲提取物處理后的大鼠皮膚組織和人角質(zhì)及成纖維細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)這兩個通路的活化程度明顯提高,從而提示上述兩個通路的活化在五谷蟲提取物促進(jìn)損傷修復(fù)過程中可能發(fā)揮重要的作用。7.RNA和蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果顯示,五谷蟲提取物處理的組織和細(xì)胞中這三個基因的表達(dá)明顯上調(diào)。由于NF-?B,Wnt2/?-catenin,Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在被檢組織和細(xì)胞內(nèi)活化程度較低或處于不活化的狀態(tài),而TGF-?/Smad3通路在一定程度上對c-Myc表達(dá)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,故認(rèn)為c-Myc,cyclin D1 and VEGF表達(dá)上調(diào)很可能是STAT3通路活化的結(jié)果。TGF-?/Smad3和STAT3對c-Myc表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)則提示,兩者在多階段損傷修復(fù)過程中可能存在某種互動和功能交替,在生物功效上也許處于動態(tài)平衡。這一點有待下一步研究證明。創(chuàng)新性本課題首次采用嶄新的創(chuàng)面信息采集和創(chuàng)面面積測算技術(shù)評估并證實三種五谷蟲提取物對大鼠皮膚損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。首次以主要的損傷修復(fù)相關(guān)信號通路及其下游靶基因作為切入點,以大鼠皮膚創(chuàng)面作為體內(nèi)模型,人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞作為體外實驗?zāi)Ｐ?系統(tǒng)地分析了五谷蟲提取物促進(jìn)損傷修復(fù)的分子機制并得出較為肯定的結(jié)論。本課題獲得的研究結(jié)果為五谷蟲提取物的高質(zhì)量制備,科學(xué)合理的使用和療效評價提供了新的理論和實驗依據(jù),故有一定的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王壽宇;呂德成;王媛媛;曹平安;;醫(yī)用五谷蟲的制備技術(shù)研究[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年01期

2 張振;王壽宇;刁云鵬;張厚利;黃珊珊;呂德成;;從中藥五谷蟲的應(yīng)用看中藥西用的策略[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報;2010年02期

3 譚曉峰;郭未艷;朱龍平;何國瑞;厲倬學(xué);楊得坡;;中藥五谷蟲油超臨界CO_2萃取及其脂肪酸組成分析[J];中國油脂;2012年10期

4 孫曉亞;張志成;曾紅;陳偉;張國剛;;蟾飼五谷蟲與五谷蟲的質(zhì)量分析[J];沈陽藥科大學(xué)學(xué)報;2013年05期

5 王壽宇;張振;李旭東;呂德成;;中藥五谷蟲抗菌物質(zhì)的分離純化及抗菌機制的實驗研究[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2013年09期

6 劉魯明,周偉強,錢華,汪國永;五谷蟲抗菌物質(zhì)抗菌活性的實驗研究[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2001年03期

7 譚磊;許蕾;解思濤;郭文韜;于海躍;馮玉華;柴玉樓;;自制蟾飼五谷蟲膠囊外用治療糖尿病足87例[J];光明中醫(yī);2012年01期

8 王壽宇;張振;刁云鵬;康廷國;呂德成;;活體五谷蟲對壓瘡創(chuàng)面的生物清創(chuàng)技術(shù)研究[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2010年04期

9 王壽宇;呂德成;王凱;孔繁勝;王江寧;;中藥五谷蟲粗提物對感染創(chuàng)面抗菌活性的實驗研究[J];組織工程與重建外科雜志;2007年02期

10 張振;刁云鵬;王壽宇;呂德成;;中藥五谷蟲促進(jìn)創(chuàng)面愈合及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的研究[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2013年04期

相關(guān)會議論文 前1條

1 王壽宇;呂德成;王凱;孔繁勝;王江寧;;中藥五谷蟲粗提物對感染創(chuàng)面抗菌活性的實驗研究[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會養(yǎng)生學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會委員會議暨第七次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 本報記者　 洪琦 張瑛;五谷蟲待字閨中難覓良緣[N];寧夏日報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 李培楠;五谷蟲新鮮提取物對體內(nèi)和體外皮膚損傷修復(fù)的促進(jìn)作用及其分子機制的分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

2 王壽宇;中藥五谷蟲對感染創(chuàng)面抗菌作用的臨床與分子機制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

3 張振;五谷蟲促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用及其機制的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 朱健;活體五谷蟲治療慢性糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面的初步研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李光偉;五谷蟲二次免疫后的抗菌物質(zhì)對金葡菌和大腸桿菌結(jié)構(gòu)影響的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

3 麥波;鴉膽子和五谷蟲的脂類抗腫瘤藥效成分的研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2009年

4 趙澤旭;五谷蟲干粉對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合及血管生成影響的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

5 張姝;五谷蟲粗提物抗菌消炎和調(diào)節(jié)動物免疫作用的初步研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

6 李文淵;常見衛(wèi)生害蟲提取物的抗菌活性研究和五谷蟲抗菌成分的鑒定[D];河南科技大學(xué);2013年

，

本文編號：2234519