【摘要】：糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy, DCM)是一種獨(dú)立的心肌疾病,每年約有2%-3%的糖尿病患者并發(fā)心血管病變。調(diào)查研究顯示：65-74歲老年組的糖尿病患者,每年因并發(fā)心肌病而致死的男性、女性分別為4.9%、3.2%,而非糖尿病患者分別為1.9%、0.9%,兩組存在顯著的差異。隨著DCM病程的進(jìn)展,患者發(fā)生心衰和再梗死的風(fēng)險增高,預(yù)后也很差,高患病率、致殘率、病死率等也導(dǎo)致患者身心健康受到嚴(yán)重的損害,為個人和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO報道,2010年全世界防治糖尿病的醫(yī)療衛(wèi)生費(fèi)用高達(dá)11.6%,2005-2015年中國用于糖尿病及相關(guān)血管疾病防治的費(fèi)用達(dá)到5577億美元。DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物途徑、氧化應(yīng)激損傷、脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞代謝障礙、心肌微血.管病變、自主神經(jīng)病變等多個方面。目前缺乏明確的診斷標(biāo)準(zhǔn),醫(yī)師需要結(jié)合患者的臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測、影像學(xué)檢查、心肌活檢等方法,在排除冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病、高血壓及其它心肌病的基礎(chǔ)上做出綜合判斷。其臨床特征,早期主要以心臟舒張功能不全為主、易發(fā)生充血性心力衰竭；后期出現(xiàn)心臟收縮功能不全、心律失常、心肌廣泛性壞死灶,最終進(jìn)展為心源性休克、心力衰竭,重癥患者甚至猝死。病理切片顯示：內(nèi)皮及內(nèi)皮下纖維增生、基膜增厚、彌漫性心肌壁內(nèi)微血管病變、毛細(xì)血管密度降低、心肌肥厚等。鑒于DCM對于患者和社會造成的巨大危害,探索其發(fā)病機(jī)制,找到有效的治療方法成為科研工作者亟待解決的問題。西醫(yī)治療主要是對癥治療為主,輔以糾正代謝紊亂,延緩心律失常、心肌梗死、心衰及其他心血管并發(fā)癥的發(fā)生。治療方面,一是強(qiáng)化控制血糖的治療；二是調(diào)脂治療,改善脂質(zhì)代謝紊亂。三是RASS拮抗劑的應(yīng)用,如ACEI、ARB及利尿劑在不同的位點(diǎn)阻斷RASS系統(tǒng),不但起到了抑制心肌重構(gòu)的作用,而且在改善心肌纖維化方面也有重要的意義。四是應(yīng)用蛋白非酶糖基化的阻滯劑；五是改善心功能不全、心律失常、心衰等癥狀的藥物和非藥物治療。中醫(yī)理論認(rèn)為本病氣陰不足為本,瘀血阻絡(luò)為標(biāo),各醫(yī)家臨床辨證論治依此為基礎(chǔ),思路見仁見智,或辨證結(jié)合辨��；或辨病論治,以一方為主,隨證加減；或以其中一種治法為主,隨證加減用藥。近年逐漸進(jìn)行深入的臨床和基礎(chǔ)研究,如中藥驗(yàn)方、復(fù)方制劑、單味中藥及其提取物、天然藥物研發(fā)等,逐步改善患者的癥狀并提高生存質(zhì)量,綜合治療仍然是基本原則。中藥有效組分配伍(簡稱中藥組分)具有多靶效應(yīng)、便于定量分析、整體治療的優(yōu)勢,為有效治療DCM提供了新的思路。目的 本研究在既往研究中藥組分(40%麥冬多糖、30%黃連生物堿、30%三七總皂苷)能夠干預(yù)蛋白非酶糖基化的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察其對DCM兔血糖相關(guān)指標(biāo)：GIU、FBG、GHB、GSP、INS、IRI、FRA、AR;血脂相關(guān)指標(biāo)TC、TG、HDL-C、 LDL-C;肝腎功能指標(biāo)：ALT、AST、Sci、BUN;氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)：AGEs、NO、 MDA、SOD、GSH-Px;炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)：hs-CRP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、bFGF、 PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、ET;凋亡相關(guān)指標(biāo)：Caspase-3、bcl-2、AI;以及TGF-β1-p38MAPK-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白表達(dá)的影響；從而探討中藥組分對p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控下心肌組織細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響,為其治療糖尿病心肌病的可能作用機(jī)制及新靶點(diǎn)提供依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)用兔70只,按隨機(jī)數(shù)字表選取10只作為空白對照組,喂養(yǎng)普通飼料,第4周末,耳緣靜脈推注0.9%氯化鈉注射液5ml,再普通飼料喂養(yǎng)8周。其余60只大兔喂養(yǎng)含2%膽固醇、0.5%膽酸和5%豬油的高脂飼料30g/(kg·d),第4周末禁食8小時,造模前稱取體重,按照100mg/kgBW劑量,耳緣靜脈推注0.9%氯化鈉注射液配制的5%四氧嘧啶。第8周測空腹血糖(FBG),選取三次均在16.7mmol/L-23.5mmol/L大兔,不符合上述FBG標(biāo)準(zhǔn)者剔除,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周。第12周末,隨機(jī)選取空白對照組大兔1只,造模組大兔2只麻醉后取材,觀察心肌病理組織顯示：與空白組比較,造模組大兔心肌細(xì)胞腫脹變性,水腫明顯,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成大量的空泡,心肌間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞間界限不清,間隙增寬,血管周圍基質(zhì)增多,間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、核裂解、固縮以及核丟失現(xiàn)象,表明糖尿病心肌病模型已經(jīng)建立。造模成功50只大兔,按照空腹血糖水平、體重均衡原則分組為：①模型對照組10只②中藥組分高劑量組10只③中藥組分中劑量組10只④中藥組分低劑量組10只⑤辛伐他汀對照組10只。第13周實(shí)驗(yàn)各組開始灌胃,用開口器撐開兔口,插入小兒胃管,檢測進(jìn)入胃部。具體劑量為：中藥組分高劑量組450mg/(kg·d)、中藥組分中劑量組150mg/(kg·d)、中藥組分低劑量組50mg/(kg·d);辛伐他汀組0.8mg/(kg·d);空白對照組及模型對照組以10ml/(kg·d)生理鹽水灌胃；2/日,連續(xù)上述藥物灌胃8周。第20周末,取材前禁食不禁水12小時,5%戊巴比妥鈉3ml/kg麻醉后取材。抽取腹主動脈血3-5ml,以Fresco離心機(jī)離心標(biāo)本,3000r/m,15min,分離血清；摘取心臟,取部分左心室組織,用10%中性甲醛溶液固定,乙醇脫水,石蠟包埋,常規(guī)的切片操作,厚度為4um；剩余左心室組織,生理鹽水沖洗,錫紙包裹,放入液氮速凍3min,放入-70℃冰箱備用。應(yīng)用比色法測定血清中GLU、FBG、GHB、GSP、NO、NOS、MDA、SOD、 GSH-Px、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FRA含量；放射免疫法測定INS含量；ELISA法測定血清中AGEs、ET、hs-CRP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、bFGF、PDGF、PAI-1、 AR、ICAM-1、VCAM-1及心肌組織中Caspase-3、bcl-2含量。Western blotting法測心肌組織中TGF-β1-p38MAPK-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。HE染色后光鏡下觀察心肌細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)、病理學(xué)改變。TUNEL法檢測心肌組織細(xì)胞凋亡并進(jìn)行凝膠圖像。結(jié)果(1)四氧嘧啶靜脈注射配合高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的大兔,第4周造模,第8周時空腹血糖平均為18.0mmol/L,顯著高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),表明糖尿病模型建立。造模后繼續(xù)配合高脂飼料喂養(yǎng),第12周時造模組大兔心肌組織病理切片顯示,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的空泡形成,細(xì)胞腫脹,炎性細(xì)胞浸潤、核裂解、固縮以及丟失,心肌間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)紊亂,基底膜增厚等,表明糖尿病心肌病模型已經(jīng)建立。(2)中藥組分對血糖相關(guān)指標(biāo)的影響：第8周時造模組FBG顯著升高,與空白對照組比較有顯著差異(P0.01)。灌胃給藥后,第16周時高劑量組對DCM模型兔的FBG有降低作用,顯著低于模型組(P0.01)；第20周時,高、中、低劑量組對FBG均有降低作用,顯著低于模型組(P0.05)；而辛伐他汀組對DCM模型兔的FBG沒有明顯降低作用(P0.05)。第20周進(jìn)行糖負(fù)荷實(shí)驗(yàn),以25%的葡萄糖(5g/kg)灌胃,分別檢測0min、30mim、60min、120min、180min的血糖值,高、中劑量組對于灌胃糖負(fù)荷后30mim、60min、120min、180min血糖值均有降低作用,與模型組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);低劑量組對糖負(fù)荷后30min血糖有降低作用,與模型組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。此外,高、中劑量組可明顯降低GSP、AR、FRA、IRI、INS含量,與模型組比較,差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)中藥組分對血脂相關(guān)指標(biāo)的影響：造模后,模型組TC、TG、LDL-C均高于空白組,HDL-C低于于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。灌胃給藥后,第20周時高、中劑量組及辛伐他汀組對TC、TG、 LDL-C均有降低作用,對HDL-C有升高作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；低劑量組降低了TC、LDL-C,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)中藥組分對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響：模型組AGEs、MDA、NO、NOS均高于空白組,SOD、GSH-Px低于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。灌胃給藥后,第20周時高、中劑量組、辛伐他汀組對MDA、NO、NOS有降低作用,對SOD、GSH-Px有升高作用；此外高、中劑量組對AGEs有抑制作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；低劑量組對NOS、AGEs有降低作用,對GSH-Px有升高作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(5)中藥組分對炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的影響：模型組hs-CRP、IL-6、ET、PDGF、 ICAM-1、VCAM-1、PAI-1均高于空白組,bFGF低于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。灌胃給藥后,第20周時高、中劑量組、辛伐他汀組對hs-CRP、IL-6、 ET、PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1有降低作用,對bFGF有升高作用；此外高劑量組對TGF-β1、TNF-α有降低作用,而辛伐他汀組對TNF-α有降低作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；低劑量組對hs-CRP、VCAM-1、PAI-1有降低作用,對bFGF有升高作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(6)中藥組分對心肌組織TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表達(dá)的影響：模型組TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表達(dá)均高于空白對照組,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。灌胃給藥后,第20周時中藥組分高、中劑量組及辛伐他汀組對TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表達(dá)均有抑制作用,與模型組比較,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),其中對p-CREB蛋白表達(dá)抑制最為明顯,治療后與空白組比較,沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異((P0.05)。低劑量組對p-p38MAPK、p-CREB蛋白表達(dá)有抑制作用,與模型組比較,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),其中對p-CREB蛋白表達(dá)抑制更為明顯,與空白組比較,沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(7)中藥組分對心肌組織病理的影響：模型組LVW、HW、H/W、LVWI均高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。灌胃給藥后,第20周時高、中劑量組及辛伐他汀組對LVW、HW、H/W、LVWI有降低作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。模型組Caspase-3、AI均高于空白組,bcl-2低于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。中藥組分高、中劑量組及辛伐他汀組對Caspase-3、AI有抑制作用,對bcl-2上調(diào)作用；低劑量組僅對bcl-2上調(diào)作用,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。(8)中藥組分對體重的影響：造模成功后,第12周時分組,各組之間體重?zé)o明顯差異(P0.05),表明分組均衡；而與空白對照組比較體重下降,有顯著差異(P0.05)。灌胃給藥后,第16周時高劑量組與模型組比較,體重上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第20周時高、中劑量組及辛伐他汀組與模型組比較,體重明顯上升,差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。(9)中藥組分對肝腎功相關(guān)指標(biāo)影響：造模后,模型組ALT、AST、BUN、Scr均高于空白對照組(P0.01)。灌胃給藥后,第20周時高、中劑量組對ALT、AST、 BUN、Scr均有降低作用,顯著低于模型組(P0.01)；辛伐他汀組對BUN、Scr均有降低作用,與模型組比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。結(jié)論(1)四氧嘧啶靜脈注射配合高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的大兔模型,造模后,第8周時造模組空腹血糖平均為18.0mmol/L,表明糖尿病模型建立。造模后繼續(xù)配合高脂飼料喂養(yǎng),第12周糖尿病心肌病模型建立。(2)中藥配伍組分可明顯降低FBG、GHB、GSP、AR、FRA含量,降低空腹血糖,改善糖耐量異常；降低IRI、INS含量,改善胰島素抵抗。(3)中藥配伍組分可降低TC、TG、LDL-C、升高HDL-C,調(diào)整血脂紊亂。(4)中藥配伍組分可降低AGEs、MDA、NO、NOS、升高SOD、GSH-Px含量,改善氧化應(yīng)激損傷。(5)中藥配伍組分可降低降低hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET、TGF-β1、PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1,升高bFGF,緩解炎癥反應(yīng)。(6)中藥組分通過調(diào)控p38MAPK/Caspase-3、bcl-2途徑,有效抑制了心肌細(xì)胞凋亡；通過調(diào)控TGF-β1-p38MAPK-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制了心肌組織異常細(xì)胞增殖、分化等的生物學(xué)效應(yīng),有效地緩解了心肌肥大、間質(zhì)纖維化等病變的進(jìn)程。(7)中藥配伍組分減輕DCM兔全心重及左心室重量,可降低左心室重量指數(shù)及心體比。(8)中藥配伍組分可明顯增加DCM兔體重。(9)中藥組分對ALT、AST、BUN、Scr均有降低作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2197887