發(fā)布時間：2018-08-20 17:48

【摘要】：研究背景 心室顫動(簡稱室顫)是心源性猝死最常見的原因。近年來,隨著電生理標測技術的進步和對心臟顫動的激動特點研究的深入,對室顫機制的認識有了很大進展,但快速心律失常要維持存在,折返激動仍是其最主要的機制。構成折返環(huán)的條件包括：①解剖上客觀存在折返環(huán)；②單向傳導阻滯；③傳導速度和不應期的不一致。在這3個基本條件中,可興奮組織的不應期是由單個細胞的電活動決定的,而單個細胞的興奮要擴布到相鄰的細胞,進而引起整個心肌組織的同步興奮,則是由細胞間電耦聯(lián)決定的,而細胞間電耦聯(lián)通過縫隙連接(gap junction,GJ)來完成,GJ是組織被動電活動的主要物質基礎。 細胞間GJ有兩種連接方式：端—端(end-to-end)連接和側—側(side-to-side)連接,心肌各向異性的結構基礎就取決于GJ的連接方式。正常心肌呈梭狀排列,長軸方向GJ中端—端連接比例大,結合處阻抗較低,離子電流易于通過,電激動傳導速度快,而短軸方向GJ中側—側連接比例大,電流通過結合處阻抗較大,電激動傳導速度慢,呈“之”字形擴布,激動被分隔而碎裂,出現(xiàn)尖銳錯折樣傳導,易于形成折返。側—側傳導比例的增加,理論上有助于心律失常的產生及維持。 縫隙連接蛋白(connexins, Cx)是構成細胞間GJ的亞單位。Cx表達水平的降低和分布異常,可使心肌整體的傳導速度減慢,傳導的各向異性改變,從而形成折返環(huán)路的解剖學基礎,誘發(fā)心律失常。在成年心室,GJ僅含有Cx43而且主要分布在閏盤內。我們前期的研究已經證實,心肌Cx43表達減少以及分布和排列紊亂造成的GJ重構參與了室顫的發(fā)生與維持,而縫隙連接增強劑ZP123可以通過減少或逆轉Cx43的降解并使其分布排列趨于均一,從而降低除顫能量,使室顫易于轉復。 Cx43屬于磷蛋白,GJ通道的功能也受Cx43磷酸化的影響。在心肌細胞,磷酸化的Cx43(p-Cx43)才能構成有功能的GJ,而去磷酸化的Cx43不具備GJ的功能。那么,室顫的發(fā)生與轉復過程中是否存在Cx43磷酸化水平的改變?Cx43磷酸化水平的改變對于室顫的維持與轉復又有著怎樣的影響作用?室顫時ZP123對縫隙連接的增強作用是否也包括上調Cx43的磷酸化水平?這些問題在我們前期的研究中未作深入探索,目前也未見相關報道。 電活動的均一性傳導除了依賴于心肌細胞間的電偶聯(lián),還受細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的影響。正常生理狀態(tài)下,心臟ECM的合成與降解維持著一動態(tài)平衡,其成分的過度生成或異常降解都可能會破壞心肌的力學性質和電生理結構,影響電活動的均一性傳導。近年來研究表明,基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)與基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitom of metalloproteinases, TIMPs)的調節(jié)對ECM的合成與降解起著非常重要的作用,在心肌組織中MMPs與TIMPs存在嚴格的平衡。這就提示,心肌MMPs/TIMPs比例失調有可能參與了室顫的發(fā)生與維持。但是MMPs與TIMPs在室顫的過程中究竟變化如何?對室顫的發(fā)生維持及預后又發(fā)揮什么樣的作用?這些問題都不清楚,都非常值得研究和探索。 血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)是腎素一血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的主要活性成分,既往的研究結果證實其廣泛參與了高血壓、左室肥厚、心力衰竭等許多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來的研究還發(fā)現(xiàn),Ang Ⅱ能夠影響左室心肌的各項電生理指標而參與惡性室性心律失常的發(fā)生,而傳統(tǒng)的降壓藥物血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素受體拮抗劑(ARB)則能通過抑制循環(huán)與局部心肌組織Ang Ⅱ的生物學效應,減少惡性室性心律失常的發(fā)生。目前關于AngⅡ致室性心律失常的具體機制尚不明確,但有研究報道,AngⅡ可以減少Cx43的表達,減慢心肌細胞間的電傳導,提示AngⅡ通過引起心肌細胞間的GJ重構而導致心肌電生理的異常。那么,這會不會就是Ang II參與室顫維持的蛋白分子機制呢? 因此,本研究擬通過建立長時程室顫動物模型,對以上未知的問題進行深入的探討。 目的 一、觀察心肌細胞膜Cx43的表達、分布及其磷酸化水平在室顫發(fā)生維持與轉復過程中的動態(tài)變化。 二、觀察心肌MMP-2/TIMP-2在室顫發(fā)生維持及轉復過程的表達變化,并分析其與室顫預后的關系。 三、觀察縫隙連接增強劑ZP123在不同室顫時程對Cx43的表達、分布及磷酸化水平的影響作用。 四、通過分析ZP123對除顫閾值、除顫成功率、ROSC和存活率等指標的影響,評價其對室顫轉復的作用效果。 五、探尋AngⅡ參與室性心律失常的蛋白分子機制。 方法 一、通過建立長時程室顫動物模型,觀察心肌Cx43及其磷酸化水平、MMP-2與TIMP-2在室顫發(fā)生與維持過程中的動態(tài)變化 (一)實驗動物準備 1.隨機選取成年家犬32只,雌雄不限。3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈靜注麻醉,氣管插管,連接呼吸機,監(jiān)測心電圖。 2.所有動物行經胸超聲檢查,測量左房內徑(LAD)、左室舒張期內徑(LVDd)和左室射血分數(shù)(LVEF)。 3.穿刺股動、靜脈,分別將壓力導管送入主動脈和右心房,在X線下確定導線位置,并連于多導電生理記錄儀,監(jiān)測與記錄主動脈收縮壓(AOSP)、主動脈舒張壓(AODP)和右房舒張壓(RADP)。冠脈灌注壓(CPP)=AOPD-RADP,平均動脈壓(MAP)=1/3AOSP+2/3AODP。 (二)室顫動物模型的建立 1.動物隨機分為4組：假手術組,8分鐘室顫組,12分鐘室顫組和30分鐘室顫組,每組8只。假手術組只麻醉插管取心肌,不予致顫。 2.致顫：將體外電刺激器火線端與零線端的導電針頭分別插入心前區(qū)左上方與右下方的皮下,以80V持續(xù)刺激5s可以成功的誘發(fā)持續(xù)性室顫。 室顫成功的標準：(1)心電圖示室顫波形；(2)主動脈壓力失去波動(近似一條直線),降至10～20mmHg以下。此時立即撤除呼吸機,模仿臨床人類室顫狀態(tài)。 (三)測定Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2在室顫不同時程中的表達水平 1.待各組持續(xù)相應的室顫時間,將動物用氯化鉀處死,迅速開胸沿左心室長軸,留取0.5cm3大小的左心室游離壁心肌組織數(shù)塊,一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分放入液氮中速凍,然后轉存至-80℃冰箱凍存。 2.分別提取心肌細胞總蛋白及細胞膜蛋白,Western blot檢測心肌細胞膜Cx43、p-Cx43,心肌MMP-2及TIMP-2的表達。 3.免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡分析Cx43和p-Cx43的表達和分布。用Image-Pro Plus6.0軟件分析熒光強度。 4.免疫組織化學染色法分析MMP-2與TIMP-2的表達水平。 二、觀察心肌Cx43、p-Cx43、MMP-2/TIMP-2、AngⅡ在室顫轉復過程中的表達變化,以及ZP123對Cx43、p-Cx43表達與分布的影響,評價ZP123對室顫轉復的作用效果,同時探尋MMP-2/TIMP-2、AngⅡ與室顫預后的關系 (一)實驗動物準備 1.隨機選取家犬48只,雌雄不限。3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈靜注麻醉,氣管插管,連接呼吸機,用體外自動除顫器監(jiān)測心電圖及血氧飽和度(Sa02)。 2.超聲心動圖及血流動力學檢測：所有動物在致顫前及自主循環(huán)恢復(ROSC)后行經胸超聲檢查,測量LAD、LVDd和LVEF。穿刺股動、靜脈,分別將壓力導管送入主動脈和右心房,在X線下確定導線位置,并連于16道多導電生理記錄儀,監(jiān)測并記錄AOSP、AODP和RADP。CPP=AOPD-RADP, MAP=1/3AOSP+2/3AODP。 (二)室顫動物模型的建立 1.實驗動物隨機分為6組：8分鐘室顫ZP123組(8-min VF+ZP123組),8分鐘室顫生理鹽水對照組(8-min VF+NS組),12分鐘室顫ZP123組(12-min VF+ZP123組),12分鐘室顫生理鹽水對照組(12-min VF+NS組),30分鐘室顫ZP123組(30-min VF+ZP123組)和30分鐘室顫生理鹽水對照組(30-min VF+NS組),每組8只。 2.藥物應用：3個ZP123組在致顫前給予ZP1231μg/kg靜推+10μg·kg-1·h-1溶于50ml生理鹽水微量泵泵入30分鐘；3個對照組給予生理鹽水50ml微量泵泵入30分鐘。 3.心前區(qū)備皮后,將體外電刺激器的導電針頭分別插入心前區(qū)左上方與右下方的皮下,待各組藥物泵完后,立即按下體外電刺激器上的綠色通電按鈕,80V,持續(xù)5s致顫。 (三)心肺復蘇及電除顫 1.待各組室顫持續(xù)相應的時間后,立即開始胸外心臟按壓(cardiopulmonary resuscitation, CPR),同時連接氣囊,按壓通氣比為30：2,通氣時不中斷按壓,通過POWERLAB系統(tǒng)監(jiān)測壓力波形判斷和保證按壓的效果,頻率控制在100-120次/min,放松時胸廓恢復到正常位置,按壓／放松時間比大致相等。 2.5個復蘇周期即2min后,進行脈搏與心律評估,仍為室顫的給予雙相波電除顫,若沒有達到ROSC,則再按照前述進行下一個2min CPR,如此循環(huán)。所有動物首次除顫能量均為70J,第二次則增至100J,第三次增至150J,以后每次除顫均為150J。對于30min內未達到ROSC的動物不再繼續(xù)復蘇,達到ROSC (AOSP≥80mmHg且至少持續(xù)1min)的動物立即給予高級生命支持,并觀察1小時。 3.計算各組平均除顫能量,除顫成功率,ROSC和存活(1小時)率。 (四)測定各組Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2的表達 1.達到實驗終點的動物用氯化鉀處死,迅速開胸沿左心室長軸,留取左室游離壁心肌組織。 2. Western blot檢測心肌細胞膜Cx43、p-Cx43,心肌MMP-2與TIMP-2的表達水平。 3.免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡分析Cx43和p-Cx43的表達和分布。 4.免疫組織化學染色法測定MMP-2及TIMP-2的表達。 (五)心肌AngⅡ含量的測定 1.制備心肌組織勻漿。 2.雙抗體夾心ELISA法測定心肌組織AngⅡ含量。 結果 一、Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2在室顫發(fā)生與維持過程中的動態(tài)變化 (一)各組動物基礎狀態(tài)的比較 各組動物在體重、心率、LAD、LVDd、LVEF及血流動力學指標等均無統(tǒng)計學差異(P0.05) (二)Cx43和p-Cx43在心室顫動發(fā)生與維持過程中的表達 1.免疫熒光染色結果 假手術組Cx43和p-Cx43熒光信號強,形態(tài)清晰,分布均勻,排列有序；室顫組隨著室顫時程的延長,Cx43和p-Cx43熒光信號逐漸減弱,形態(tài)模糊,排列紊亂,呈現(xiàn)不均一分布。 2. Western blot分析結果 圖像定量分析結果顯示,與假手術組相比,心肌細胞膜Cx43表達水平隨室顫時程延長明顯下降(P0.05)。12分鐘室顫組和30分鐘室顫組心肌細胞膜p-Cx43表達水平明顯減少(P0.05),而8分鐘室顫組與假手術組相比無明顯統(tǒng)計學差異,但仍有下降趨勢(P0.05)。 3.p-Cx43/Cx43比值隨室顫時程延長而不斷減小(P0.05) (三)MMP-2與TIMP-2在心室顫動發(fā)生與維持過程中的變化 1.免疫組化與Western blot結果顯示,與假手術組相比,室顫組TIMP-2表達水平隨室顫時程的延長明顯減少(P0.05)。8分鐘室顫組MMP-2表達水平與假手術組無統(tǒng)計學差異(P0.05),但是在另外兩個長時程室顫組(12分鐘和30分鐘室顫組)MMP-2表達水平明顯增加(P0.05與假手術組比較)。 2.室顫組MMP-2/TIMP-2比值較假手術組升高,而且隨室顫時程延長逐漸增加(P0.05)。 p-Cx43/Cx43與MMP-2/TIMP-2的比值變化 相關分析結果顯示,p-Cx43/Cx43與MMP-2/TIMP-2呈顯著負相關(r=—0.93,P0.01)。 二、心肌Cx43、p-Cx43、MMP-2/TIMP-2、AngⅡ在室顫轉復過程中的表達變化及ZP123的作用 (一)各組動物基礎狀態(tài)指標的比較 致顫前,各組動物體重、心率、LAD、LVDd、LVEF及血流動力學指標等均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 (二)實驗終點各組存活的動物超聲與血流動力學指標的比較 對各組復蘇后恢復自主循環(huán)并存活超過1小時的家犬進行超聲與血流動力學指標統(tǒng)計分析顯示,8分鐘室顫、12分鐘室顫的ZP123組和NS對照組LAD、LVDd均較室顫前明顯增大(P0.05),而LVEF則較室顫前明顯下降(P0.05),且12分鐘室顫ZP123組和NS對照組LAD、LVEF與8分鐘室顫的同治療組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05), LVDd值雖然也比8分鐘室顫的同治療組增大,但未達統(tǒng)計學差異,血流動力學指標除RADP與室顫前無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),其余指標AOSP、AODP、MAP及CPP四組均較室顫前明顯降低(P0.05)。30分鐘室顫的兩個實驗組因存活家犬數(shù)量過少,未進行統(tǒng)計學分析。 (三)實驗終點各組動物除顫成功率、平均除顫能量以及存活率的比較 8分鐘室顫ZP123治療組8只家犬全部成功除顫,其中有7只在前三次除顫成功復律,且7只全部達到ROSC并存活；8分鐘室顫NS對照組有7只獲得成功除顫,其中4只在前三次除顫成功復律,共有6只達到ROSC并存活1小時以上。12分鐘室顫ZP123治療組有7只家犬成功除顫,其中5只在前三次除顫中復律并成功達到ROSC,4只存活時間大于1小時；同時程室顫的NS對照組有5只除顫成功,其中2只是在前三次除顫中復律,4只家犬達到了ROSC但僅3只存活超過1小時。30分鐘室顫ZP123治療組有2只家犬獲得成功除顫,但均未達到ROSC；同時程NS組有1只除顫成功并存活。 統(tǒng)計學分析結果顯示,8分鐘和12分鐘室顫ZP123組前三次除顫成功率均明顯高于同時程室顫NS對照組(P0.05),且所用平均除顫能量顯著低于同時程室顫NS對照組(P0.05)。盡管ZP123用藥組的自主循環(huán)恢復率和存活率與同室顫時程的NS對照組相比,差異未達到統(tǒng)計學顯著性(P0.05),但8分鐘和12分鐘室顫ZP123組均較同時程的NS對照組有著相對較高的自主循環(huán)恢復率和存活率。 (四)用藥后各ZP123組與對照組心肌Cx43與p-Cx43的表達變化 1.免疫熒光染色結果 各ZP123組的Cx43和p-Cx43熒光信號均較同時程室顫生理鹽水對照組強,形態(tài)更加清晰,分布更加均勻,排列更加有序；且隨著室顫時程的延長,ZP123組和對照組Cx43. p-Cx43熒光信號逐漸減弱,形態(tài)模糊,排列紊亂,呈現(xiàn)不均一分布。 2. Western blot分析結果 圖像定量分析結果顯示,與假手術組相比,3個ZP123治療組和3個對照組心肌胞膜Cx43表達水平均明顯降低(P0.05或P0.01),12分鐘室顫和30分鐘室顫ZP123治療組Cx43表達水平高于同時程室顫NS對照組(P0.05),8分鐘室顫ZP123治療組與NS對照組Cx43表達水平無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 隨室顫時間的延長,各組心肌細胞膜p-Cx43表達水平逐漸下降,不同時程室顫ZP123治療組心肌細胞膜p-Cx43表達水平均明顯高于同時程室顫NS對照組(P0.05)。 3. p-Cx43/Cx43比值變化 p-Cx43/Cx43比值隨室顫時程延長逐漸減小,且不同時程室顫ZP123治療組p-Cx43/Cx43比值高于同時程室顫NS對照組(P0.05)。 (五)治療組與對照組心肌AngⅡ含量測定結果 與假手術組相比較,各ZP123治療組與NS對照組心肌Ang Ⅱ含量均顯著增加(P0.05或P0.01),且隨室顫時程的延長,心肌Ang Ⅱ含量逐漸升高,但同時程室顫ZP123治療組與NS對照組相比,心肌Ang Ⅱ含量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 (六)不同室顫時程存活組與死亡組心肌MMP-2與TIMP-2表達水平 1.免疫組織化學染色與Western blot結果 通過統(tǒng)計學分析,同時程室顫ZP123組與NS對照組相比,心肌MMP-2和TIMP-2的表達均無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。但是對實驗終點時各時程室顫的存活家犬與死亡家犬心肌MMP-2和TIMP-2的表達水平進行統(tǒng)計學分析比較,結果顯示,8分鐘與12分鐘時程室顫存活組心肌MMP-2表達水平較死亡組略高,但差異無顯著性(P0.05),存活組心肌TIMP-2表達水平顯著高于同時程室顫死亡組(P0.05)。30分鐘時程室顫組因存活動物過少,未進行統(tǒng)計學分析。 2. MMP-2/TIMP-2比值 8分鐘與12分鐘時程室顫存活組MMP-2/TIMP-2比值均明顯低于同時程室顫死亡組(P0.05) (七)不同時程室顫存活組與死亡組心肌AngⅡ含量比較 通過對各時程室顫存活家犬與死亡家犬的心肌Ang Ⅱ含量進行比較發(fā)現(xiàn),存活組家犬心肌Ang Ⅱ含量均明顯低于同時程室顫死亡組(P0.05)。30分鐘時程室顫組因存活動物過少,未進行統(tǒng)計學分析。 (八)各指標的相關性分析 相關性分析結果顯示,心肌細胞膜Cx43表達水平與除顫成功率呈顯著正相關(r=0.91,P0.01)；心肌細胞膜Cx43表達水平與平均除顫能量呈顯著負相關(r=-0.854,P0.01)；心肌細胞膜磷酸化Cx43表達水平與前三次除顫成功率呈顯著正相關(r=0.926,P0.01)；NS對照組心肌細胞膜Cx43和p-Cx43表達水平均與心肌Ang Ⅱ含量呈顯著負相關(r=-0.945、-0.909,P0.01)；心肌TIMP-2表達水平與心肌AngⅡ含量呈顯著負相關(r=-0.947,P0.01)。 結論 1.室顫的發(fā)生發(fā)展過程中,心肌細胞膜Cx43發(fā)生了重構,不僅表現(xiàn)為Cx43表達量的減少,排列和分布的紊亂,還包括磷酸化Cx43比例的減少和非磷酸化Cx43比例的增加,并且隨著室顫時程的延長,Cx43重構表現(xiàn)得更為明顯�？p隙連接增強劑ZP123能通過減輕Cx43重構,包括上調心肌細胞膜Cx43表達,減少去磷酸化,使Cx43排列與分布趨于均一,改善心肌細胞間縫隙連接電耦聯(lián),從而降低除顫能量,提高除顫成功率。 2.心肌MMPs與TIMPs調節(jié)失衡導致的細胞外基質重構參與了室顫的發(fā)生與維持,且NMMPs/TIMPs表達失衡與室顫復蘇死亡率相關,其作用機制可能是通過引發(fā)復蘇時心肌缺血再灌注損傷。 3.在室顫的發(fā)展過程中,縫隙連接重構與細胞外基質重構是伴隨發(fā)生的。 4.AngⅡ既能通過下調Cx43表達,降低Cx43磷酸化水平,引起GJ重構,又能通過破壞MMPs/TIMPs平衡導致心肌缺血再灌注損傷,二者作用的共同結果就是促使室顫更易于維持,不易轉復,而且增加復蘇后心肌損傷,不利于室顫預后。而ARB降低室性心律失常發(fā)生率與死亡率的機制,可能正是因為阻滯了Ang Ⅱ的上述效應。 5.預防性應用ARB類藥物可能會降低室顫的發(fā)生率和死亡率。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R541.75

【參考文獻】

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本文編號：2194486