【摘要】：1背景肺動脈高壓(PAH)是一種嚴重威脅人類健康的疾病,它常伴有多種肺臟和心臟的疾病而導致發(fā)病率和死亡率增加,目前仍沒有有效的治療方法。PAH的發(fā)病機制十分復雜,目前我們?nèi)圆磺迤渚唧w的發(fā)病機制。報道發(fā)現(xiàn)在PAH的發(fā)病過程中常常伴有血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞以及炎癥細胞增生和聚集。血管平滑肌細胞(VSMC)具有多種細胞表型,存在于血管的中間層,正常情況下處于靜息狀態(tài),以維持血管的緊張度。當處于病理條件下,有些VSMC就轉(zhuǎn)變成“合成型”,分泌炎性細胞因子從而導致血管發(fā)生病理改變。當前認為,肺動脈進展性的重塑是造成肺動脈高壓肺動脈難以治療的主要原因,而VSMC的增生則是造成肺動脈重塑的一個重要因素。近年來,免疫機制在肺動脈高壓的發(fā)病機制中受到越來越多的關(guān)注,但是免疫調(diào)節(jié)機制是如何促進肺動脈高壓發(fā)病的機制仍不清楚。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)是一組特殊的T細胞亞群,它的主要作用是調(diào)控免疫反應,控制免疫反應的進展,如果Tregs數(shù)量減少或功能異常則會導致免疫紊亂。Tregs已經(jīng)被證實在很多疾病中具有有效的治療效果,但是其在肺動脈高壓的治療作用仍不清楚。此研究主要就是研究Tregs是否能影響肺動脈高壓發(fā)病并探討其中的作用機制。2目的(1)在體內(nèi)試驗中,觀察Tregs對小鼠肺動脈的炎癥反應和血管重塑的影響；(2)在體外試驗中,探討Tregs抑制平滑肌細胞增生的機制。3方法3.1動物模型8周齡的60只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為常氧組、對照組和Tregs組,每組20只。對照組和Tregs組在含氧的10%低氧箱中喂養(yǎng),常氧組與對照組和Tregs組均在同一個房間中喂養(yǎng)4周。所有的小鼠食物和水源都是一致的,實驗第4周后安樂處死。3.2分選和轉(zhuǎn)移分離8周齡雄性C57BL/6J小鼠脾細胞,利用磁珠分選技術(shù)獲得純化的TregS。純化的Tregs按要求分別溶于200 u 1 CD4+CD25+ regulatory T PBS中。小鼠在放入低氧箱前一天,Tregs組小鼠通過小鼠尾靜脈注入Tregs (106 cells),對照組小鼠注入PBS。3.3血流動力學檢測將小鼠麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺上,使用小鼠氣管插管。使用26號測量管經(jīng)劍突下途徑經(jīng)皮穿至胸腔,通過其末端鏈接的壓力傳感器測量并記錄右心室收縮壓(RVSP)數(shù)據(jù)。整個過程中,小鼠可自然呼吸,并且其心率均維持在300-600次／分。小鼠處死后,將小鼠左心室與室間隔作為一個整體與右心室剝離,并分別測量其質(zhì)量,以計算Fulton's旨數(shù)。3.4體重及血脂實驗的0周和4周末,分別測量每組小鼠的體重。4周末檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。3.5細胞培養(yǎng)利用磁珠分選將Tregs細胞從健康人群外周血單核細胞中游離。將人肺動脈平滑肌細胞(HPASMCs)在含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中傳至第四代,放在低氧條件下培養(yǎng)(1% O2,5% CO2), 分為對照組和Tregs組。Tregs組加入Tregs (5 ×105/well)共培養(yǎng),對照組不加入T細胞,二者均加入抗-CD3抗體(50ng/ml)在37°C培養(yǎng)48小時。3.6 hPASMC的增值測定使用MTT法測定hPASMCs增值。在96孔板中以每孔5000個細胞的密度種植,在放置缺氧條件前加入或不加入Tregs,在10 μL MTT (5mg/mL)/孔37℃條件下孵育4小時。去掉上清液后,加入DMSO75 μL/孔。使用全波長多功能掃描儀以570 nm波長分析樣本。使用6孔板以相同的密度種植hPASMCs,并在上述條件下進行處理。使用結(jié)束時使用PBS沖洗,胰酶處理,使用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。3.7 RT-PCR搜集小鼠的肺或肺動脈平滑肌細胞,提取RNA,測量肺Foxp3,MCP-1,IL-1β, IL-6, IL-10以及肺動脈平滑肌細胞cyclin Dl, CDK4, p27, Akt及ERK mRNA的表達。3.8 Western blot搜集小鼠的肺或肺動脈平滑肌細胞,提取蛋白,測量肺Foxp3, MCP-1, IL-1 β, IL-6, IL-10以及肺動脈平滑肌細胞cyclin Dl, CDK4, p27, Akt及ERK蛋白的表達。4結(jié)果4.1動物一般情況各組小鼠體重以及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平濃度無顯著統(tǒng)計學差異。4.2 Tregs增加了Foxp3的表達Foxp3在Tregs特異性的表達,是Tregs的分化成熟和起效的必要性的標志。此實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)小鼠尾靜脈注入Tregs的小鼠肺臟中,Foxp3 mRNA的表達明顯高于對照組。此結(jié)果證實外源性Tregs可以進入到小鼠的組織中。4.3 Tregs可降低缺氧誘導升高的肺動脈壓和右心室的肥厚右心室收縮壓(RVSP)與肺動脈壓(PAP)有絕對的正向關(guān)系。相對于常氧組小鼠,低氧條件下小鼠的RVSP是升高的。使用Tregs處理的小鼠其RVSP明顯降低。慢性缺氧可以導致右心室的肥厚,我們在這個研究中測量了Fulton's指數(shù),結(jié)果顯示缺氧條件下可伴有Fulton's指數(shù)的增加,而在Tregs組其Fulton's指數(shù)在部分程度上得以降低。此結(jié)果表明Tregs可以改善缺氧誘導的肺動脈壓力和右心室肥厚。4.4 Tregs可以下調(diào)炎癥因子的表達,上調(diào)抑炎因子的表達。在小鼠肺組織中,我們通過RT-PCR方法,發(fā)現(xiàn)Tregs組促炎性因子MCP-1,IL-1 β和IL-6的表達明顯低于對照組。MCP-1, IL-1β和IL-6的蛋白表達水平也是相似的結(jié)果。此外我們也發(fā)現(xiàn)抗炎性介質(zhì)IL-10在Tregs組明顯高壓對照組。這些結(jié)果表明Tregs可以降低促炎性細胞因子的表達而上調(diào)抗炎性細胞因子的表達。4.5 Tregs可減少缺氧造成的hPASMCs的增生。我們通過MTT方法發(fā)現(xiàn)相對于缺氧組,Tregs可以抑制HPASMCs的增生。細胞計數(shù)分析也得到了相似的結(jié)論。我們認為Tregs對HPASMC的抑制作用是減緩肺動脈高壓進展的重要機制。4.6Tregs促使缺氧的hPASMCs停留在G1/G0期細胞的增值依賴于由G1/G0期轉(zhuǎn)到G2/S期。此實驗發(fā)現(xiàn),通過Tregs處理的HPASMCs,與對照組相比,有更大比率的細胞處在G1/G0期。4.7 Tregs可減少cyclin D1和CDK4表達,增加p27的表達。cyclin D1, CDK4和p27在細胞增值及細胞周期中起到關(guān)鍵的作用。我們發(fā)現(xiàn)在體外實驗的HPASMCs中,cyclin D1, CDK4的mRNA和其蛋白表達水平都較Tregs組的明顯降低,而在Tregs處理的HPASMCs中,其p27的mRNA蛋白表達都明顯高于對照組。這個結(jié)果表明Tregs通過調(diào)節(jié)細胞周期的方式是減緩肺動脈高壓發(fā)病發(fā)展的另外一個機制。4.8 Tregs降低Akt和ERK1/2磷酸化水平。已經(jīng)有報道,Akt和ERK是肺動脈平滑肌細胞增生的主要途徑之一。我們通過western blo方法檢測體外的HPASMCs表達的Akt和ERK蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn),相對于對照組,Tregs可以明顯下調(diào)Akt和ERK蛋白的磷酸化水平。5結(jié)論(1) Tregs可以緩解缺氧誘導的肺動脈高壓的形成；(2)其主要的機制是Tregs可以明顯抑制炎癥反應,增強抗炎性反應,調(diào)整細胞增值周期,抑制hPASMCs的增生；(3) Tregs可能成為治療肺動脈高壓的一個有效的方法。1背景:肺動脈高壓(PA戰(zhàn)不僅僅是一種疾病,而是一系列的疾病的統(tǒng)稱,它嚴重威脅著人類健康,其發(fā)病機制仍不清楚。它共有的特征是復雜的血管內(nèi)皮的增生和持續(xù)進展的肺血管的重塑,血管的平滑肌細胞增生在血管重塑過程中起到不可或缺的作用。缺氧性肺動脈高壓是肺高壓的一種重要的臨床亞型,我們常見的慢性阻塞性肺疾病及肺間質(zhì)纖維化常常伴有缺氧性肺動脈高壓,其中有報道慢阻肺急性加重的病人中有91%伴有肺高壓,它可進一步導致右屯、室肥厚甚至右也室衰減,這直接決定了病人的預后。目前對肺高壓仍沒有肯定的治療方法。精氨酸酶(Argnase Arg)是作用于尿素循環(huán)的酶,可W將精氨酸轉(zhuǎn)化成尿素和鳥氨酸,精氨酸酶2(Arg2)主要在腎臟、血管平滑肌細胞的線粒體基質(zhì)內(nèi),它是缺氧誘導的人肺動脈平滑肌細胞增生有關(guān)的特異性精氨酸酶亞型。近來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在缺氧性肺動脈離壓中,精氨酸的表達明顯X椉，

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