本文選題：剪切力 + 內(nèi)皮細(xì)胞�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是最常見的心血管疾病之一,它的發(fā)病機(jī)理一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。動脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于血管分叉、彎曲及狹窄等部位。局部剪切力的變化與斑塊分布特異性密切相關(guān)。在血管平直區(qū)域,平穩(wěn)的血流產(chǎn)生方向單一的生理性脈沖剪切力(剪切力≥12dyne/cm2),具有抑動脈粥樣硬化形成的保護(hù)作用。而在血管分叉等處,渦流產(chǎn)生,血流變?yōu)榉较蛭蓙y,速度明顯降低的震蕩剪切力(剪切力0±4dyne/cm2),這一剪切力則具有促動脈粥樣硬化形成的作用。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于整個血管腔,直接接觸血流,長期處于血流剪切力的刺激下,能夠感受血流力學(xué)的變化,傳遞信號,維持血管穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈粥樣硬化形成早期的關(guān)鍵步驟。DKK家族是進(jìn)化過程中十分保守的基因家族,主要包括DKK1、DKK2、 DKK3及DKK4四個成員,其中DKK1的研究最為廣泛。DKK1是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的分泌型抑制劑,可與細(xì)胞膜上Krumen、LRP5/6等受體結(jié)合,阻礙正常Wnt受體復(fù)合物的形成,促進(jìn)胞質(zhì)中β-catenin的磷酸化降解,影響下游相關(guān)基因的表達(dá),關(guān)閉Wnt通路,進(jìn)而影響相應(yīng)的生物學(xué)功能。既往研究發(fā)現(xiàn),DKK1與心血管疾病的發(fā)生密切關(guān)系。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清及人的頸動脈及冠狀動脈斑塊中高表達(dá)的DKK1均提示DKK1與動脈粥樣硬化相關(guān)。但是,DKKI在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中所起的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚,剪切力刺激下內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)有著怎樣的變化亦未見報(bào)道。研究目的1.探討不同剪切力對血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；2.明確DKK1在不同剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子表達(dá)中的作用；3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確DKK1在病理剪切力作用區(qū)域動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用及相關(guān)分子機(jī)制,研究方法1.體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的提取與培養(yǎng)無菌條件下獲取一段長約15-20cm的剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,利用胰酶消化法提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,以10% M199培養(yǎng)基重懸于小號細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)于37℃、5%C02孵箱中,次日換液,清除未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞長至融合,傳代繼續(xù)培養(yǎng)。2.體外不同剪切力干預(yù)體外培養(yǎng)至4-7代的HUVECs用于剪切力干預(yù)實(shí)驗(yàn)。載玻片高壓滅菌,包被I型鼠尾膠原,HUVECs種于其上,待細(xì)胞密度達(dá)到約90%,分別給予靜止培養(yǎng)或3、6、12、24小時的生理性脈沖剪切力或病理性震蕩剪切力刺激,觀察不同剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的影響。3.小鼠頸總動脈部分結(jié)扎模型的構(gòu)建通過小鼠頸總動脈部分結(jié)扎建立左側(cè)頸總動脈病理剪切力模型,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察不同剪切力對血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的影響。8周齡雄性C57BL/6小鼠麻醉后,于頸部正中切開皮膚,鈍性分離左頸總動脈,找到其四個分支,手術(shù)線結(jié)扎左頸內(nèi)動脈、左頸外動脈及左頭臂動脈,保留左甲狀腺上動脈血流通暢。術(shù)后第二天行小鼠頸動脈超聲觀察術(shù)后左頸總動脈的血流情況,48小時后取材行蛋白質(zhì)印跡檢測已證實(shí)受剪切力調(diào)控的相關(guān)分子的表達(dá)變化,評估造模是否成功。4.小鼠主動脈及頸總動脈en face免疫熒光染色(1)小鼠主動脈取材：正常的8周齡雄性C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔麻醉、心臟灌流、4%甲醛溶液固定后,分離主動脈弓及胸主動脈,大體解剖顯微鏡下去除血管周圍的結(jié)締組織,縱行剖開主動脈弓及胸主動脈,進(jìn)行en face染色。(2)小鼠頸總動脈取材：左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后48小時,手術(shù)組及假手術(shù)對照組C57BL/6小鼠經(jīng)麻醉,灌注及固定后,行左側(cè)頸總動脈取材,鏡下去除周圍結(jié)締組織,縱向剖開,以行en face染色。en face免疫熒光染色步驟如下：將剖開的主動脈弓及頸總動脈置于含0.5%Triton X-100的PBS溶液中通透10分鐘,封閉,一抗4℃孵育過夜,相應(yīng)的熒光二抗孵育,DAPI染核,激光共聚焦顯微鏡下觀察并留取照片。5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染5.1 DKK1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染的DKK1 siRNA及陰性對照siRNA均由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成,轉(zhuǎn)染依照lip2000說明書進(jìn)行,轉(zhuǎn)染6小時后更換培養(yǎng)基,依照實(shí)驗(yàn)分別給予細(xì)胞相應(yīng)的刺激,轉(zhuǎn)染24-48小時后進(jìn)行相應(yīng)檢測。5.2 DKKl基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染DKK1基因過表達(dá)慢病毒載體及攜帶綠色熒光蛋白GFP的空載體均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成,轉(zhuǎn)染依照慢病毒操作手冊進(jìn)行,轉(zhuǎn)染48小時后,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。6.實(shí)時熒光定量PCR分析Trizol法提取HUVECs及組織中的總RNA,濃度測定后,利用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。依照TaKaRa公司的SYBR Green使用說明配置體系,進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。引物購自上海吉瑪生物技術(shù)公司。7.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting, WB)利用RIPA提取相應(yīng)的HUVECs及組織蛋白,煮沸變性,SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%牛奶封閉,一抗4℃孵育過夜,洗膜,相應(yīng)的二抗常溫孵育,化學(xué)發(fā)光,分析蛋白條帶灰度值。8.免疫熒光染色不同刺激后的HUVECs,經(jīng)固定、封閉后,一抗4℃孵育過夜,相應(yīng)的熒光二抗37℃避光孵育1小時,染核、封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。9.單核細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)人單核／巨噬細(xì)胞系購自ATCC,懸浮培養(yǎng)于10% RPMI-1640培養(yǎng)基中。HUVECs刺激結(jié)束前15分鐘,羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)標(biāo)記單核細(xì)胞,標(biāo)記后的單核細(xì)胞與相應(yīng)的HUVECs于37℃孵箱中共培養(yǎng)1小時,PBS洗去未結(jié)合的單核細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)分析。10.慢病毒轉(zhuǎn)染干擾DKKI表達(dá)對病理剪切力作用區(qū)域AS發(fā)生的影響10.1小鼠DKKl基因干擾慢病毒載體的構(gòu)建構(gòu)建小鼠DKK1基因干擾的shRNA慢病毒載體(shRNA-DKK1),以攜帶綠色熒光蛋白GFP的慢病毒空載體作為陰性對照。10.2頸總動脈部分結(jié)扎AS模型的構(gòu)建及相關(guān)病理學(xué)檢測90只8周齡雄性ApoE-/-小鼠經(jīng)2周適應(yīng)性喂養(yǎng)后過渡至高脂喂養(yǎng),分為以下三組：(1)Con組(n=30)：尾靜脈注射100μ1生理鹽水；(2)Scramble組(n=30)：尾靜脈注射10μl,5×107ifu的空載體病毒懸液；(3)shRNA-DKK1組(n=30)：尾靜脈注射100μl,5×107ifu的shRNA-DKK1病毒懸液。轉(zhuǎn)染2周后,熒光顯微鏡觀察小鼠頸總動脈冰凍切片中GFP熒光強(qiáng)度,實(shí)時熒光定量PCR及Western Blotting檢測小鼠頸總動脈組織中DKK1表達(dá)情況,評估慢病毒轉(zhuǎn)染效率。剩余小鼠全部行左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎手術(shù)構(gòu)建病理剪切力模型,繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。1周后,每組隨機(jī)選取16只小鼠,行左側(cè)頸總動脈en face染色觀察血管內(nèi)皮與血液循環(huán)中單核細(xì)胞的黏附情況及血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子的表達(dá)變化,行Western Blotting檢測DKK1干擾對內(nèi)皮細(xì)胞黏附及緊密連接相關(guān)分子表達(dá)的影響。其余小鼠于手術(shù)結(jié)扎后3周給予安樂死,留取左側(cè)頸總動脈,制備冰凍切片,HE及油紅O染色檢測DKK1干擾對病理剪切力作用區(qū)域AS發(fā)生的影響。10.3長期高脂喂養(yǎng)AS模型的構(gòu)建及相關(guān)病理學(xué)檢測30只8周齡雄性ApoE-/-小鼠經(jīng)2周適應(yīng)性喂養(yǎng)過渡至高脂喂養(yǎng)后平均分為三組,同急性AS模型組,即Con組,Scramble組及shRNA-DKK1組,每組10只。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)高脂喂養(yǎng),每隔1個月追加一次尾靜脈注射。3個月后給予小鼠安樂死,留取主動脈弓,制備冰凍切片,油紅O染色觀察DKKI干擾對主動脈弓小彎側(cè)及其分叉處血流紊亂區(qū)域AS發(fā)生的影響。11.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。非配對t檢驗(yàn)用于兩樣本間比較,多樣本間比較運(yùn)用ANOVA單因素方差分析,P0.05認(rèn)為存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.病理剪切力上調(diào)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)小鼠主動脈弓小彎側(cè)血管內(nèi)皮主要承受促動脈粥樣硬化的病理性震蕩剪切力及低剪切力,而胸主動脈直段血管內(nèi)皮承受抑動脈粥樣硬化的生理性脈沖剪切力。主動弓小彎側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)量明顯高于胸主動脈直段(P0.05)。小鼠左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎建立病理剪切力模型,與假手術(shù)組相比,手術(shù)組頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)。說明在體內(nèi),促動脈粥樣硬化的病理性剪切力可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)。2.脈沖剪切力下調(diào)HUVECs中DKK1的表達(dá),震蕩剪切力上調(diào)HUVECs中DKK1的表達(dá)與靜止對照組相比,脈沖剪切力下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1 mRNA及蛋白表達(dá),脈沖剪切力作用3小時及6小時DKK1表達(dá)下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；震蕩剪切力上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1 mRNA及蛋白表達(dá),與靜止對照組相比,震蕩剪切力作用6小時及12小時DKK1表達(dá)上調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。分別給予HUVECs脈沖剪切力或震蕩剪切力刺激6小時,免疫熒光染色顯示,脈沖剪切力刺激后HUVECs中DKK1表達(dá)量顯著降低(P0.05),而震蕩剪切力刺激后HUVECs中DKK1的表達(dá)量則顯著升高(P0.05)。3.DKK1參與不同剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的調(diào)節(jié)與靜止對照組相比,脈沖剪切力抑制內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的黏附(P0.05),下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)(P0.05)；而過表達(dá)DKK1,與空載體陰性對照相比,能夠阻斷脈沖剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附的抑制作用(P0.05),上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM1、ICAM1及E-selectin黏附分子的表達(dá)(P0.05)。與靜止對照組相比,震蕩剪切力促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的黏附(P0.05),上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)(P0.05)；DKK1siRNA轉(zhuǎn)染能夠下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)(P0.05),阻斷震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附的促進(jìn)作用(P0.05)。4.DKK1參與不同剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)節(jié)與靜止對照組相比,脈沖剪切力上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子ZO1、Z02、occludin及Claudin 5的表達(dá)(P0.05)；而過表達(dá)DKK1,與空載體陰性對照組相比,上述分子的表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。與靜止對照組相比,震蕩剪切力下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin 5的表達(dá)(P0.05)；而干擾DKK1表達(dá),上述分子的表達(dá)均上調(diào)(P0.05)。5.DKK1干擾抑制病理剪切力作用區(qū)域AS的發(fā)生慢病毒轉(zhuǎn)染后2周,ApoE-/-小鼠頸總動脈內(nèi)有明顯的GFP表達(dá)。與Con及Scramble對照組相比,shRNA-DKK1組小鼠頸總動脈中DKK1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P0.05),說明轉(zhuǎn)染安全有效。高脂喂養(yǎng),頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后3周,ApoE-/-小鼠結(jié)扎側(cè)(左側(cè))頸總動脈中有明顯的AS斑塊生長。與Con對照組相比,shRNA-DKKl組AS斑塊病變范圍顯著降低(P0.05)。高脂喂養(yǎng)3個月,ApoE-/-小鼠主動脈弓小彎側(cè)及主動脈弓分支處病理剪切力作用區(qū)域可見明顯斑塊生長。與Con對照組相比,shRNA-DKK1組上述部位AS斑塊病變范圍顯著下降(P0.05)。6.DKK1干擾抑制ApoE-/-小鼠病理剪切力作用區(qū)域血管內(nèi)皮與單核細(xì)胞黏附頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后1周,與Con對照組相比,shRNA-DKKl組ApoE-/-小鼠結(jié)扎側(cè)(左側(cè))頸總動脈血管內(nèi)皮與單核細(xì)胞的黏附顯著降低,內(nèi)皮黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)亦顯著下調(diào)(P0.05)。7.DKK1干擾上調(diào)ApoE-/-小鼠病理剪切力作用區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子的表達(dá)左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后1周,Western Blotting及en face免疫熒光染色結(jié)果均顯示,與Con對照組相比,shRNA-DKK1組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin 5的表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05)。結(jié)論1.脈沖剪切力下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá),震蕩剪切力上調(diào)其表達(dá)；2.DKK1參與不同剪切力對血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)節(jié)；3.DKK1能夠通過促進(jìn)血管內(nèi)皮與單核細(xì)胞的黏附及下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子的表達(dá)促進(jìn)病理剪切力作用區(qū)域動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生。研究背景動脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于血管分叉、分支及狹窄等病理性震蕩剪切力及低剪切力作用區(qū)域,內(nèi)皮細(xì)胞位于血管壁管腔內(nèi)面,直接暴露于血流剪切力刺激下,能夠感受局部環(huán)境的變化并傳遞力學(xué)信號,影響相關(guān)基因的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是早期動脈粥樣硬化發(fā)生的重要步驟。內(nèi)皮細(xì)胞表面(管腔面、細(xì)胞間連接處及基底面)具有眾多的力學(xué)感受器,這些分子被活化后能夠同時激活細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響多種核轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)基因剪切力反應(yīng)元件(Shear stress responsive elements,SSREs)的結(jié)合,進(jìn)而影響相應(yīng)的細(xì)胞功能。在血管分叉等震蕩剪切力及低剪切力作用區(qū)域,內(nèi)皮細(xì)胞中具有抑動脈粥樣硬化作用的基因表達(dá)被抑制,而促動脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)該區(qū)域動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。臨床研究報(bào)道DKK1與動脈粥樣硬化疾病密切相關(guān)。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)病理性的震蕩剪切力上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá),加速內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子的表達(dá)下調(diào),進(jìn)而促進(jìn)病理剪切力作用區(qū)域動脈粥樣硬化的發(fā)生。但震蕩剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。DKK1除了作為Wnt/β-catenin通路的抑制劑外,同時還是β-catenin的靶基因。β-catenin能夠與其輔激活蛋白TCF/LEF核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,調(diào)節(jié)DKK1的表達(dá)。蛋白酶激活受體1(Protease activated receptorl, PAR1)是一種七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體,能夠參與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及血管通透性等過程的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),PAR1能夠活化黑色素瘤細(xì)胞中的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB),上調(diào)其黏附分子MCAM/MUC18的表達(dá),促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。PAR1/CREB通路以及P-catenin分子是否能夠介導(dǎo)震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的調(diào)節(jié)尚未見報(bào)道。近年來,長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)的作用受到關(guān)注。LncRNA參與細(xì)胞分化、表觀遺傳以及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞內(nèi)多種過程的調(diào)控。新近的研究發(fā)現(xiàn),LncRNA分子NBAT1能夠通過調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中DKKl的表達(dá),進(jìn)而影響乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。NBAT1是否能在內(nèi)皮細(xì)胞中介導(dǎo)震蕩剪切力對DKK1的調(diào)節(jié)有待研究證實(shí)。研究目的1.明確β-catenin在震蕩剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞DKK1表達(dá)中的作用；2.明確PAR1/CREB通路在震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞DKK1表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用；3.明確內(nèi)皮細(xì)胞中LncRNA NBAT1在震蕩剪切力對DKK1表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用及其與β-catenin及PAR1/CREB通路的關(guān)系。研究方法1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的體外提取與培養(yǎng)無菌條件下獲取剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,胰酶消化法提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,重懸于10% M199培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),24小時后換液。待細(xì)胞長至融合,傳代培養(yǎng)。2.體外不同剪切力干預(yù)體外培養(yǎng)至4-7代的HUVECs接種于高壓滅菌,提前包被I型鼠尾膠原的載玻片上。待細(xì)胞密度達(dá)到約90%,給予靜止培養(yǎng)或0.5、1、3、6小時震蕩剪切力干預(yù),觀察震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中β-catenin、PAR1、CREB及NBAT1表達(dá)的影響,并找到適宜的刺激時間,用于后續(xù)研究。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的β-catenin、PAR1、CREB、NBAT1以及陰性對照siRNA均由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成,依照lip2000轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染,6小時后更換培養(yǎng)基,依照實(shí)驗(yàn)給予細(xì)胞相應(yīng)的刺激,轉(zhuǎn)染后24-48小時行相應(yīng)檢測。4.實(shí)時熒光定量PCR利用Trizol法進(jìn)行HUVECs中總RNA的提取,濃度測定后,利用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。依照TaKaRa公司的SYBR Green使用說明配置體系,進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。引物均購自上海吉瑪生物技術(shù)公司。5.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting, WB)利用RIPA進(jìn)行HUVECs蛋白的提取,蛋白樣本煮沸變性后,行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%牛奶封閉,一抗孵育,洗膜,相應(yīng)的二抗孵育及化學(xué)發(fā)光,獲得蛋白條帶后利用Photoshop CS5進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。6.熒光原位雜交(Fluorescencein situ hybridization,FISH)LncRNA NBAT1原位雜交探針以及相應(yīng)的FISH試劑盒均自銳博生物公司購入,操作依照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。待檢測的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定及通透后,加入NBAT1原位雜交探針雜交過夜,次日洗去未結(jié)合的探針,染核、封片后進(jìn)行熒光檢測。7.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。非配對t檢驗(yàn)用于兩樣本間比較,多樣本間比較運(yùn)用ANOVA單因素方差分析,P0.05認(rèn)為存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.β-catenin參與震蕩剪切力對HUVECs中DKKl的上調(diào)分別給予HUVECs不同時間的震蕩剪切力刺激,Western Blotting結(jié)果顯示與靜止對照組相比,震蕩剪切力干預(yù)組HUVECs中p-β-catenin含量下降,β-catenin的表達(dá)上調(diào)。siRNA轉(zhuǎn)染干擾β-catenin表達(dá),Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)震蕩剪切力干預(yù)下HUVECs中DKK1的表達(dá)上調(diào)被抑制,提示β-catenin參與震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)調(diào)節(jié)。2. PAR1/CREB通路參與震蕩剪切力對HUVECs中DKKl的上調(diào)Western Blotting檢測震蕩剪切力干預(yù)不同時間,內(nèi)皮細(xì)胞中PAR1及CREB的表達(dá)變化,結(jié)果顯示：與靜止對照組相比,震蕩剪切力上調(diào)HUVECs中PAR1的表達(dá),促進(jìn)CREB的表達(dá)及磷酸化。分別進(jìn)行相應(yīng)siRNA轉(zhuǎn)染干擾PAR1及CREB的表達(dá),均可發(fā)現(xiàn)震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)上調(diào)被抑制。同時,PAR1 siRNA干擾或加入PAR1抑制劑后,與陰性對照組相比,內(nèi)皮細(xì)胞中CREB的表達(dá)及磷酸化均被抑制,提示震蕩剪切力干預(yù)下,PAR1能夠通過調(diào)節(jié)CREB的表達(dá)及活化影響DKK1的表達(dá)。3.NBAT1參與介導(dǎo)震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的調(diào)節(jié)震蕩剪切力分別干預(yù)HUVECs不同時間,實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與靜止對照組相比,震蕩剪切力干預(yù)下NBAT1的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。給予內(nèi)皮細(xì)胞震蕩剪切力干預(yù)6小時,FISH結(jié)果顯示NBAT1主要表達(dá)于細(xì)胞核中,與靜止對照組相比,震蕩剪切力顯著上調(diào)其表達(dá)。NBAT1 siRNA轉(zhuǎn)染,HUVECs中震蕩剪切力對DKK1的上調(diào)被抑制(P0.05),提示NBAT1參與介導(dǎo)震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)調(diào)節(jié)。4. NBAT1不通過影響β-catenin的蛋白表達(dá)介導(dǎo)震蕩剪切力對DKKl的調(diào)節(jié)給予]HUVECs siRNA轉(zhuǎn)染干擾NBAT1表達(dá),Western Blotting檢測細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)NBAT1干擾對P-catenin的蛋白含量沒有顯著影響,提示NBAT1不通過影響β-catenin的蛋白表達(dá)參與震蕩剪切力對DKK1的調(diào)節(jié)。5.NBAT1通過PAR1/CREB通路介導(dǎo)震蕩剪切力上調(diào)DKKl的表達(dá)NBAT1 siRNA轉(zhuǎn)染干擾其表達(dá),給予震蕩剪切力刺激,Western Blotting檢測PAR1與CREB的表達(dá)變化以及CREB磷酸化水平的改變,結(jié)果顯示：NBAT1干擾后,震蕩剪切力刺激下PAR1、CREB的表達(dá)及CREB的磷酸化水平的上調(diào)均被抑制,提示NBAT1能夠通過PAR1/CREB通路參與介導(dǎo)震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)調(diào)節(jié)。結(jié)論(1)β-catenin參與震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的上調(diào)；(2)NBAT1能夠通過活化PAR1/CREB通路介導(dǎo)震蕩剪切力對DKK1的表達(dá)調(diào)節(jié)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
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本文編號：2093510