本文選題：神經(jīng)病理性疼痛 + 痛敏��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景神經(jīng)病理性疼痛(Neuroapthic pain, NP)在2008年被國際疼痛學(xué)會(Intrenational Association for the Study of pain, IASP)下設(shè)的神經(jīng)病理性疼痛特別興趣小組(NeuPSIG)將神經(jīng)病理性疼痛更新定義為由軀體感覺系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛。神經(jīng)病理性疼痛按照損傷部位可分為周圍性疼痛及中樞性疼痛兩種類型。常見的周圍性神經(jīng)病理性疼痛有：三叉神經(jīng)痛、根性神經(jīng)病變(頸、胸或腰骶)、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病周圍神經(jīng)病變、嵌壓性神經(jīng)病變(腕管綜合征等)、創(chuàng)傷后神經(jīng)痛、殘肢痛等等；常見的中樞性神經(jīng)病理性疼痛有：腦卒中后疼痛、脊髓空洞癥疼痛、脊髓損傷性疼痛、缺血性脊髓病疼痛、壓迫性脊髓病(脊髓型頸椎病、腫瘤)疼痛等等。神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生有很多原因,臨床特點(diǎn)為：1、自發(fā)痛：是指在沒有外傷及損傷性刺激的情況下,局部區(qū)域可出現(xiàn)疼痛；2、非傷害性刺激即可引起疼痛：疼痛可因?yàn)檩p微的刺激或微小的溫度變化而誘發(fā)；3、痛覺過敏-機(jī)體對正常致痛刺激可出現(xiàn)較強(qiáng)的痛覺反應(yīng)；4、疼痛的性質(zhì)多種多樣：疼痛可表現(xiàn)為牽扯樣痛、電擊樣痛、針刺樣痛、燒灼樣痛等；5、異常感覺：可出現(xiàn)感覺遲鈍、麻木、瘙癢感等不適癥狀。而神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜,最主要的原因可能由于神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)的改變以及神經(jīng)功能受損,從而引起外周和/或中樞敏化、背根神經(jīng)節(jié)或脊髓內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞活化、腦干或大腦皮層下行的抑制系統(tǒng)失能、神經(jīng)元細(xì)胞離子通道發(fā)生改變等等,從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷、神經(jīng)源性炎癥、神經(jīng)末梢興奮性改變、交感神經(jīng)系統(tǒng)異常以及神經(jīng)的可塑性改變等等一系列的病理生理變化,最終引發(fā)各類的疼痛表現(xiàn)。神經(jīng)病理性疼痛2008年IASP推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：1、疼痛有明確的神經(jīng)解剖范圍；2、病史提示患者的周圍或中樞感覺神經(jīng)系統(tǒng)中存在相關(guān)的疾病或損害；3、至少有一項(xiàng)輔助檢查證實(shí)了疼痛的分布范圍符合神經(jīng)解剖的范圍；4、至少有一項(xiàng)輔助檢查證實(shí)存在疼痛相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損害。目前,臨床上對神經(jīng)病理性疼痛的治療效果欠佳,一線用藥為加巴噴丁、普瑞巴林等鈣離子拮抗劑以及抗抑郁藥物,也可給以卡馬西平、奧卡西平等鈉通道阻斷劑或局部給予利多卡因治療,但臨床上約有一半的患者疼痛不能得到有效緩解。根性神經(jīng)痛是一種臨床上較為常見的神經(jīng)病理性疼痛類型,它的發(fā)生是由于脊神經(jīng)根或神經(jīng)節(jié)受到某些傷害性刺激(如腰椎間盤突出、脊髓腫瘤的壓迫、腰椎管狹窄或炎性物質(zhì)的刺激等)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥、興奮性增強(qiáng)而引起的疼痛。大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)持續(xù)受壓(chronic compression of DRG, CCD)模型是實(shí)驗(yàn)研究中典型的神經(jīng)病理性疼痛模型,造模成功后,CCD大鼠可出現(xiàn)自發(fā)性的疼痛、機(jī)械痛敏、熱痛敏和異常疼痛,并且伴隨有神經(jīng)元自發(fā)性放電的增加、動作電位降低,且出現(xiàn)電流閾值降低。DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上存在有多種離子通道,其中一種跨膜的離子通道：瞬時感受器電位離子通道家族中香草素受體亞家族4(transient receptor potential vanilloid receptor 4, TRPV4)的作用越來越受到關(guān)注。我們前期的研究(國家自然基金項(xiàng)目30472006)發(fā)現(xiàn)TRPV4參與了CCD導(dǎo)致的DRG的高興奮性、痛覺過敏和異常疼痛,喬內(nèi)注釋TRPV4反義核苷酸干擾序列后,CCD導(dǎo)致的疼痛閾值的降低可被部分逆轉(zhuǎn),而對大鼠的基礎(chǔ)疼痛閾值無影響。但TRPV4傳導(dǎo)CCD大鼠痛覺過敏和異常疼痛的通路機(jī)制和分子基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步研究。DRG是感覺信號傳入通路上的第一級神經(jīng)元,CCD模型中DRG神經(jīng)元持續(xù)受壓,導(dǎo)致神經(jīng)元胞體興奮性增加,電活化之后產(chǎn)生大量持久的異位放電,上行可引起脊髓和高位中樞的敏化,從而引起自發(fā)疼痛、痛覺過敏及觸誘發(fā)痛等神經(jīng)病理痛癥狀,所以說,DRG可以稱為神經(jīng)病理性痛的信號源；抑制損傷后DRG神經(jīng)元的異位放電可以抑制慢性疼痛信號。產(chǎn)生放電的神經(jīng)纖維主要包括介導(dǎo)刺痛的細(xì)的有髓鞘的Aδ類軸突纖維和介導(dǎo)灼痛的無髓鞘的C類纖維,且不同神經(jīng)纖維在不同狀態(tài)下的放電形式不同。我課題組先前的實(shí)驗(yàn)證明(基金號：81071597),TRPV4參與CCD模型中DRG的異常放電,但其傳導(dǎo)異常放電的機(jī)制尚未明確；且TRPV4介導(dǎo)的DRG異常放電以哪類纖維為主,以及TRPV4的激活對放電形式的影響都需進(jìn)一步研究。疼痛的傳導(dǎo)起始于背根神經(jīng)節(jié)中的初級感覺神經(jīng)元,經(jīng)神經(jīng)纖維的中樞端將傷害性信息傳向脊髓背角,傳入神經(jīng)纖維的中樞端止于脊髓背角的中間神經(jīng)元,中間神經(jīng)元再發(fā)出上行神經(jīng)纖維組成脊髓丘腦側(cè)束等痛覺傳導(dǎo)束,進(jìn)一步將傷害性信息上傳至背側(cè)丘腦和大腦皮層,經(jīng)加工整合最后產(chǎn)生痛覺。在CCD模型中,對DRG的慢性壓迫,使其缺血、水腫,促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放,引起DRG神經(jīng)元的興奮性增高,將傷害性刺激信號傳入脊髓背角,進(jìn)而興奮脊髓背角,產(chǎn)生痛敏和異常疼痛。脊髓背角神經(jīng)元的過度興奮,可能參與CCD后神經(jīng)病理性疼痛的中樞敏化機(jī)制。本課題組前期的研究主要著眼于CCD后的外周敏化機(jī)制的研究,但脊髓背角作為傷害性信息傳導(dǎo)通路中不可或缺的重要組成部分,亟需進(jìn)一步的研究。也有研究表明外周組織及神經(jīng)的炎癥使脊髓內(nèi)TRPV1、TRPA1及TRPM8表達(dá)上調(diào),而有關(guān)TRPV4在脊髓背角處的變化與疼痛信號傳遞的研究甚少。外周絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinases, MAPKs)系統(tǒng)廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,主要包括ERK(胞外信號調(diào)節(jié)激酶)、JNK(c-jun氨基末端蛋白激酶)和p38(高滲甘油反應(yīng)激酶)三個亞系統(tǒng),以磷酸化形式來發(fā)揮生物效應(yīng)。MAPK信號通路分子接受細(xì)胞表面的受體傳遞的胞外刺激,并將其轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后反應(yīng),從而將胞外刺激同胞內(nèi)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)目標(biāo)聯(lián)系起來,在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究證實(shí),MAPK信號通路與神經(jīng)病理性疼痛的形成與發(fā)展密切相關(guān)。在炎性痛、神經(jīng)瘤疾病、脊髓損傷以及部分神經(jīng)病理性疼痛模型的病理生理機(jī)制中,外周絲裂原活化蛋白激酶家族(ERK、JNK和p38)通過對現(xiàn)有蛋白的表達(dá)后修飾以及對一些關(guān)鍵基因在表達(dá)時的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),進(jìn)而以其磷酸化形式來對在外周傷害感受器或者背角神經(jīng)元產(chǎn)生的痛覺起維持和放大作用,而且局部注射MAPK家族的抑制劑可以明顯抑制機(jī)械和熱痛覺過敏。在CCD大鼠中,p-ERK的表達(dá)增加,抑制p-ERK的表達(dá)可導(dǎo)致DRG神經(jīng)元的興奮性降低。CCD模型中,DRG持續(xù)受壓后,TRPV4基因、蛋白的表達(dá)量增加,低滲溶液和4 α-PDD引起的TRPV4通道開放增加,通過TRPV4的電流內(nèi)流增加,細(xì)胞內(nèi)鈣峰值升高。研究表明,細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高可以使MAPK家族激活和磷酸化,從而介導(dǎo)MAPK發(fā)揮其生物作用。如離體和在體研究均證實(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可使p38MAPK激活和磷酸化,從而介導(dǎo)機(jī)械痛敏及炎性痛敏。在染色體隱性多囊性腎病中,TRPV4亦可通過調(diào)節(jié)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平進(jìn)而調(diào)節(jié)B-Raf/ERK的活性和表達(dá)。有研究表明C類纖維受到刺激時,ERK和P38發(fā)生磷酸化和活化,而A類纖維受到刺激時,ERK亦有部分磷酸化。CCD模型中, p-ERK表達(dá)增加,應(yīng)用U0126抑制p-ERK的表達(dá)可導(dǎo)致DRG神經(jīng)元的興奮性降低,產(chǎn)生動作電位的電流閾值和平均基強(qiáng)度升高。因此,我們猜測,CCD模型中,TRPV4參與了DRG持續(xù)受壓所致神經(jīng)病理性疼痛的外周敏化及中樞敏化機(jī)制,其中TRPV4通道的變化可調(diào)節(jié)MAPK通路的活性和表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)其在神經(jīng)病理性疼痛外周敏化中的生物作用�；谝陨涎芯窟M(jìn)展,本研究采用神經(jīng)纖維電生理技術(shù)、Real-time PCR、 Western Blot、免疫組織化學(xué)及免疫熒光等方法研究TRPV4-MAPK途徑在CCD模型所致痛敏和DRG神經(jīng)元異常放電中的作用,同時研究了脊髓背角內(nèi)TRPV4蛋白表達(dá)及分布的變化,以期為神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生探討新理論。第一部分：TRPV4-p38 MAPK通路在大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓致神經(jīng)病理性疼痛中的作用目的1.研究干預(yù)TRPV4及p38 MAPK通路是否會影響大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓所致神經(jīng)病理性疼痛。2.研究大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV4與p38 MAPK是否存在相互影響關(guān)系。方法1.大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓模型制作采用體重約為180-220g的健康成年雄性Wistar大鼠(購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),以水合氯醛(0.3ml/l00g體重)腹腔麻醉后,暴露右側(cè)L4及L5椎間外孔,將直徑0.63mm“L”形棒的一端沿L4及L5椎間外孔的前壁與脊柱斜向上成30。角插入椎間孔內(nèi),另一端位于椎間孔外。術(shù)后用生理鹽水沖洗切口,依次縫合肌肉、腰背筋膜和皮膚,術(shù)中采用無菌操作,術(shù)后給予青霉素腹腔注射以預(yù)防感染。剔除術(shù)后出現(xiàn)自殘現(xiàn)象或出現(xiàn)感覺完全缺失的大鼠。2.鞘內(nèi)注射以異氟烷和氧氣混合吸入麻醉大鼠。大鼠皮膚消毒后,以雙側(cè)髂棘連線與脊柱的交點(diǎn)定位L4/L5椎間隙,向下一椎間隙及L5/L6椎間隙進(jìn)針,微量注射器針頭沿食指尖端刺入椎間隙(針頭方向略偏向前方),至有突破感,大鼠出現(xiàn)側(cè)向快速甩尾,表明進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔,小心回抽,無血液回流,以1ul/s的速度緩慢推注,鞘注完畢后快速抽出微量注射器,按壓注射部位約lmin,防止腦脊液漏出。結(jié)束操作,停止吸入麻醉,大鼠lmin內(nèi)可恢復(fù)翻正反射。3.神經(jīng)行為學(xué)測定-機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)痛閾的測量室溫25℃,安靜明亮,將大鼠置于長*寬*高分別為40cm*20cm*40cm的紅色半透明玻璃籠內(nèi),底部及頂部無玻璃覆蓋,底部鋪以0.5cm*0.5cm的金屬網(wǎng)格。大鼠適應(yīng)環(huán)境20分鐘后,以BME-404型電子式機(jī)械測痛儀進(jìn)行測試。以針刺端垂直刺激大鼠足底第三、四趾間皮膚,大鼠出現(xiàn)縮爪或舔足現(xiàn)象視為陽性,記錄刺激數(shù)值(G),每次刺激間隔5min,連續(xù)測5次,取其平均值作為統(tǒng)計變量。4. TRPV4和P38蛋白含量測定選取大鼠術(shù)側(cè)L4及L5背根神經(jīng)節(jié),冰上快速取材,提取總蛋白,采用SDS-PAGE凝膠電泳方法分離蛋白,將分離后的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜,用5%牛奶室溫封閉2h,4℃一抗孵育過夜,二抗孵育2小時,顯影。檢測CCD術(shù)后及給予各激動劑和抑制劑后大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV4及P38表達(dá)變化。5.大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元TRPV4及P38免疫組織化學(xué)染色處死大鼠,用預(yù)冷的生理鹽水和4%多聚甲醛依次灌注,先快后慢,待灌注液清亮后,快速冰上取出術(shù)側(cè)L4及L5背根神經(jīng)節(jié),制作石蠟切片,92-98℃抗原修復(fù)15分鐘,兔抗大鼠TRPV4及P38一抗4℃孵育過夜,HRP結(jié)合的二抗室溫孵育2小時。DAB染色,蘇木素復(fù)染,進(jìn)行TRPV4及P38蛋白定位。6.異位放電記錄造模后3-8天,大鼠水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g),小心去除腰骶段椎板,充分暴露腰膨大、馬尾及L5背根神經(jīng)節(jié),切斷L5外周端及周圍交通支,以中斷外周及其他節(jié)段的感覺傳入；將大鼠背部兩側(cè)皮膚懸吊,形成浴槽,浴槽內(nèi)加入適量37℃的人工腦脊液；分離L5神經(jīng)節(jié)前纖維,輕放于引導(dǎo)電極上,用37℃的液體石蠟覆蓋,參考電極刺入大鼠骶尾部皮下,通過BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄神經(jīng)放電。結(jié)果1.鞘內(nèi)注射激動劑及抑制劑后CCD大鼠機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值的變化CCD術(shù)后第二天大鼠機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值明顯下降,持續(xù)至14天(P0.01),之后恢復(fù)至正常水平。給予RR和SB203580后,與鹽水組相比,機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值增高。給予4 α-PDD和anisomycin后,機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值明顯降低。藥物注射后2小時,反應(yīng)最明顯,沒有明顯的劑量依賴性。2.CCD大鼠鞘內(nèi)注射激動劑和抑制劑后TRPV4和p38蛋白表達(dá)的變化RR和4 α-PDD的使用濃度分別為1 nmol/L,10 nmol/L和100 nmol/L; SB203580的使用濃度為10 μmol/L,20 Wnol/L和40 μmol/L; anisomycin的使用濃度為5 μg/mL,25 μg/mL和40 μg/mL.鞘內(nèi)注射1、2、4、8小時后檢測TRPV4, p38和P-p38的表達(dá)變化。對照組CCD大鼠鞘內(nèi)注射等體積生理鹽水。TRPV4, p38和P-p38的表達(dá)可被RR明顯抑制(2-4 h for TRPV4; 1-8 h for p38 1-4 h for P-p38), RR對TRPV4和p38蛋白表達(dá)的影響具有劑量依賴性。鞘內(nèi)注射4α-PDD后,TRPV4蛋白表達(dá)增高(2h),同時p38和P-p38的表達(dá)也上調(diào),且具有劑量依賴性。鞘內(nèi)注射SB203580可顯著抑制p38和P-p38 (4 h for p38; 2-4 h for P-p38)的蛋白表達(dá),但TRPV4 (1-8 h)的表達(dá)明顯上升且不具有劑量依賴性。鞘內(nèi)注射anisomycin后；p38蛋白表達(dá)顯著增高(1-2 h),TRPV4的表達(dá)顯著降低(1-8h),P-p38的表達(dá)無明顯變化,無明顯的劑量依賴性。3.CCD大鼠鞘內(nèi)注射TRPV4和P38激動劑或抑制劑后蛋白分布的變化背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)大、中、小神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)TRPV4和p38均有陽性表達(dá)(small 30 μm, middle 30 μm-40 μm, large 40 μm)。 CCD術(shù)后陽性細(xì)胞數(shù)目增加,并可被鞘內(nèi)注射的激動劑或抑制劑影響。計數(shù)分析結(jié)果顯示,TRPV4陽性的小體積神經(jīng)元及總神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(P0.01,與對照組相比)。鞘內(nèi)注射RR和SB203580后,TRPV4陽性的小體積神經(jīng)元及總神經(jīng)元細(xì)數(shù)目減少(P0.01)。鞘內(nèi)注射anisomycin后,與對照組相比,總的陽性細(xì)胞數(shù)目增加(P0.01)。與對照組相比,CCD大鼠大、中、小體積的P38陽性細(xì)胞數(shù)目均明顯增加,(P 0.05, large; P 0.01, medium, small and total)。鞘內(nèi)注射SB203580后,P38陽性的小體積神經(jīng)元和總神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目均明顯減少(P0.01),鞘內(nèi)注射4 α-PDD (P 0.01)和anisomycin后(P0.01)P38陽性的小體積神經(jīng)元和總神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目均明顯減少。4.鞘內(nèi)注射TRPV4和P38激動劑或抑制劑對背根神經(jīng)節(jié)異位放電的影響。正常對照大鼠很少出現(xiàn)異位放電,各組間異位放電的頻率無明顯差異。然而,RR組及SB203580組放電幅度明顯減低(P0.01),4α-PDD和anisomycin組放電幅度明顯增加(P0.01)。結(jié)論1.干預(yù)TRPV4及p38 MAPK通路可影響大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓所致神經(jīng)病理性疼痛的程度,TRPV4及p38 MAPK參與了CCD后神經(jīng)病理性疼痛的形成。2.大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV4與p38 MAPK存在相互影響關(guān)系。第二部分：MAPK通路參與介導(dǎo)大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后的神經(jīng)病理性疼痛目的研究MAPK通路是否參與大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后神經(jīng)病理性疼痛的形成與發(fā)展實(shí)驗(yàn)動物及方法1.實(shí)驗(yàn)動物及造模健康成年雄性Wistar大鼠,購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,體重180-2208,室內(nèi)層流濾菌,室內(nèi)溫度20+-2℃,每籠兩只,維持12小時晝夜節(jié)律,水、食持續(xù)供給。大鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境7天后開始進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)經(jīng)過山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。采用10%水合氯醛(300mg/100gi.p.)腹腔注射,將不銹鋼棒插入右側(cè)L4、L5椎間外孔,假手術(shù)組手術(shù)方式同手術(shù)組,僅不插入鋼棒。剔除出現(xiàn)自噬、感覺缺陷及殘疾的大鼠。2.行為學(xué)測試于術(shù)前、術(shù)后4天及給藥后2小時進(jìn)行機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閡值測定。采用BEM-404型機(jī)械刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制)檢測機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值的變化。將刺激針對準(zhǔn)大鼠足底第三、四足趾間皮膚,緩慢均勻施加刺激力,出現(xiàn)縮爪或舐足為陽性反應(yīng),記錄此刻施加的力,間隔5min再次測試,重復(fù)5次,取平均值。3.蛋白免疫印跡術(shù)后4天,鞘內(nèi)注射MAPKs抑制劑后2小時,處死大鼠,冰上快速取術(shù)側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)。提取總蛋白,采用5%及10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%牛奶室溫封閉2小時,一抗4℃孵育過夜,HRP結(jié)合的二抗室溫孵育1小時,發(fā)光顯影。一抗為兔抗大鼠ERK多克隆抗體(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠p-ERK多克隆抗體(1:2000, CST, USA),兔抗大鼠JNK多克隆抗體(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠p-JNK多克隆抗體(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠P38多克隆抗體(1:200, CST, USA),兔抗大鼠p-P38多克隆抗體(1:1000, CST, USA).4.背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元p38, ERK, JNK免疫組織熒光染色采用5%異氟烷將大鼠深度麻醉,經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水和4%多聚甲醛灌注后,取手術(shù)側(cè)L4和L5被跟神經(jīng)節(jié),4%多聚甲醛4℃后固定過夜,脫水后石蠟包埋,制作不連續(xù)石蠟切片,切片厚度4um。一抗4℃孵育過夜,一抗分別為：兔抗大鼠ERK多克隆抗體(1:200, CST, USA),兔抗大鼠JNK多克隆抗體(1:200, CST, USA),兔抗大鼠P38多克隆抗體(1:50, CST, USA),采用小鼠抗大鼠NF200多克隆抗體(1:1,000, Abeam, Cambridge, UK)標(biāo)記背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。二抗為Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG (H+L)和Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(H+L),二抗混合后室溫孵育2小時。DAPI染核10min后,采用抗熒光淬滅封片劑封片,觀察。使用Olympus-u-rf1-t/dp 72自動熒光顯微鏡觀察,采集圖片,采用IPP.6進(jìn)行圖像分析,計數(shù)陽性細(xì)胞,每種抑制劑(SB203580, U0126 and SP600125)取6只大鼠。5. Real-time quantitative RT-PCRL4及L5背根神經(jīng)節(jié)快速冰上取材,提取總RNA,測定濃度。p38, JNK, ERK和β-actin的引物序列分別為:p38 (forward,5'-CCTGCGAGGGCTGAAGTA-3'; reverse, 5'-ACGGACCAAATATCCACTGTCT-3'), JNK(forward,5'-AGCCTTGTCCTTCGTGTC-3'; reverse, 5'-AAAGTGGTCAACAGAGCC-3'), ERK1(forward,5'-CCAGAGTGGCTATCAAGA AG-3'; reverse, 5'-TCCATGAGGTCCTGAACAA-3'), ERK2(forward,5'-TGCCGTGGAACAGGTTGT-3'; reverse, 5'-TGGGCTCATCACTTGGGT-3'), β-actin (forward,5'-AGACCTTCAACACCCCAG-3'; reverse, 5'-CACGATTTCCCTCTCAGC-3').6.主要試劑SB203580(p38抑制劑,CST, USA,推薦濃度=40 Wnol/L), SP600125 (JNK抑制劑,CST, USA,推薦濃度=50 μnol/L) and U0126 (ERK抑制劑,CST, USA,推薦濃度=40 μmol/L).試劑采用DMSO溶解,儲存至-20℃,鞘內(nèi)注射時用生理鹽水稀釋至使用濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。結(jié)果1.CCD術(shù)后機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值的變化CCD術(shù)后4天大鼠術(shù)側(cè)機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值明顯降低(n=8 in each group, **P0.01)。 CCD誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏可被SB203580, SP00125或U0126 (n=8 in each group,#P0.05)緩解,假手術(shù)組與對照組相比,無明顯差異。2.背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)p38、erk及jnk蛋白表達(dá)的變化CCD術(shù)后,大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)p38、erk及jnk蛋白表達(dá)及磷酸化水平顯著增高(n=5,*p0.05,**p0.01與對照組相比;#p0.05,##p0.01與假手術(shù)組相比)。CCD誘導(dǎo)的MAPKs蛋白表達(dá)及磷酸化水平增高可被相應(yīng)的抑制劑抑制(SB203580 for p38, SP600125 for JNK, U0126 for ERK)(p0.05,p0.01與CCD組相比).3.背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)p38、erk及jnk基因表達(dá)的變化MAPK通路抑制劑不僅可以抑制CCD術(shù)后大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)p38,ERK和JNK蛋白表達(dá),也可影響其基因表達(dá)。CCD術(shù)后大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)p38,JNK和ERK基因表達(dá)上調(diào)(n=6,*p0.05,**p0.01與對照組相比)。CCD誘導(dǎo)的MAPK基因水平上調(diào)可被其特異性抑制劑抑制(n=6,##p0.01與CCD組相比)。4. p38, ERK和JNK在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的分布變化在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)p38, JNK和ERK均有表達(dá),與對照組相比,CCD術(shù)后,NF200標(biāo)記的大、中神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯增加(n=6,*p0.05,**p0.01)。SB203580,SP600125或U0126鞘內(nèi)注射后,NF200陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少(n=6,#p0.05,##p0.01與CCD組相比)。NF200陰性的小體積神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目無明顯變化。結(jié)論1. MAPK通路參與大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制2.抑制MAPK通路可緩解CCD誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛第三部分：大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后脊髓背角TRPV4蛋白表達(dá)及分布的變化目的探討大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓(CCD)后瞬時感受器電位離子通道香草素亞族受體4(TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表達(dá)及分布規(guī)律。方法1.實(shí)驗(yàn)分組選取清潔級雄性Wistar大鼠30只,按隨機(jī)數(shù)字表法分組：空白對照組5只,手術(shù)組25只(術(shù)后4天、7天、14天、28天各5只；免疫熒光組5只)。2.制備大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓模型手術(shù)方式同第一部分。3.行為學(xué)檢測于造模成功后4天,7天,14天及28天,測量機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)痛閾,觀察機(jī)械痛閾的變化。4.蛋白免疫印跡技術(shù)利用western blot技術(shù)檢測空白對照組及術(shù)后4天,7天,14天及28天,手術(shù)側(cè)及對側(cè)脊髓背角TRPV4蛋白表達(dá)的變化。5.免疫熒光技術(shù)利用免疫熒光技術(shù)檢測術(shù)后4天,手術(shù)側(cè)與對側(cè)脊髓背角TRPV4陽性細(xì)胞分布。結(jié)果1.大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后機(jī)械痛閾變化手術(shù)組分別于術(shù)前及背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后4天、7天、14天、28天測量大鼠機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)痛閾,對照組同時進(jìn)行測量。與術(shù)前相比,術(shù)后4天,7天及14天時機(jī)械痛閾值明顯下降,差異有顯著性意義(n=5,P0.001)；對照組不同時間測量結(jié)果無明顯差異。2.脊髓背角TRPV4蛋白表達(dá)變化于術(shù)后4,7,14與28天進(jìn)行完行為學(xué)測試后取材。與空白對照組比較,大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后4天及7天,手術(shù)側(cè)脊髓背角TRPV4表達(dá)升高,差異有顯著性意義(n=5,p0.01)；14天及28天,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。手術(shù)對側(cè)與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3、脊髓背角TRPV4陽性細(xì)胞數(shù)目變化大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓4天后,手術(shù)側(cè)及對側(cè)均存在TRPV4陽性細(xì)胞,熒光信號分布于胞質(zhì)及胞膜上,軸丘處熒光信號集中。共5只大鼠,每只大鼠選取5張不連續(xù)切片,統(tǒng)計高倍視野內(nèi),脊髓背角TRPV4陽性細(xì)胞數(shù)目。相較于對側(cè),手術(shù)側(cè)脊髓背角內(nèi)TRPV4陽性細(xì)胞數(shù)目較多,差異有顯著性意義(n=5,p=0.0008)。結(jié)論大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后,機(jī)械痛閾下降的同時,手術(shù)側(cè)脊髓背角內(nèi)TRPV4蛋白表達(dá)上調(diào)及陽性數(shù)目增多,TRPV4可能參與CCD后神經(jīng)病理性疼痛的中樞敏化機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741

【引證文獻(xiàn)】

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1 張華勝;;神經(jīng)病理性疼痛中背根神經(jīng)節(jié)交感神經(jīng)芽生的機(jī)制研究[J];中國社區(qū)醫(yī)師;2017年24期

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本文編號：2073062