發(fā)布時間：2018-06-26 17:39

  本文選題：縮宮 + 正常��； 參考：《山東大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分 縮宮素對正常大鼠腸系膜傳入神經(jīng)敏感性及內(nèi)臟痛覺的影響 目的： 縮宮素(Oxytocin, OT)是一種由含二硫鍵的九肽激素,廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官。我們近些年的研究發(fā)現(xiàn),OT是消化道的一種內(nèi)源性神經(jīng)肽,調(diào)節(jié)消化道的運動和分泌等功能。OT在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的鎮(zhèn)痛作用。疼痛是很多功能性胃腸疾病的共同癥狀,臨床缺乏有效的治療手段。有研究提示OT能緩解腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)病人和內(nèi)臟高敏感大鼠的疼痛癥狀,但機制不清。本研究的目的是探究OT對大鼠腸系膜傳入神經(jīng)機械和化學敏感性及內(nèi)臟痛覺的影響,以期揭示OT在消化道傳入神經(jīng)水平的鎮(zhèn)痛作用及其機制。 方法： 1.腸段準備與離體腸系膜傳入神經(jīng)放電記錄 大鼠2%戊巴比妥鈉麻醉后,行腹正中切開術,游離長約2cm帶有腸系膜血管的空腸段并固定于器官灌流浴槽。持續(xù)腸腔內(nèi)外灌流并供給95%O2和5%CO2。腸段近心端與壓力換能器相連以記錄腸內(nèi)壓變化。拉出腸系膜血管束及結締組織到外槽,分離腸系膜血管旁神經(jīng)束和結締組織,分別置于雙極鉑金記錄電極。神經(jīng)放電信號經(jīng)CED前置放大器后經(jīng)Micro1401系統(tǒng)輸入電腦,用Spike2軟件記錄和分析。 2.建立大鼠內(nèi)臟高敏感模型將硅膠導管一端系有氣囊,另一端與內(nèi)臟擴張器相連。大鼠吸入異氟醚輕微麻醉后,將氣囊自肛門插入結直腸內(nèi),使氣囊末端深入肛門內(nèi)1-2cm,固定硅膠管。每只大鼠接受1h結直腸擴張(Colorectal distension, CRD)刺激,即將氣囊迅速充氣至80mmHg,維持30s后放氣,經(jīng)30s間隔后再次充氣,該充放氣循環(huán)反復60次。 3.痛覺敏感性的行為學測試 內(nèi)臟高敏感模型建立4h后,進行痛覺反應的行為學測試。通過梯度式CRD刺激,向囊內(nèi)依次注射0.4ml、0.8ml、1.2ml和1.6ml的水,每次擴張持續(xù)20s,刺激間隔5min,反復2-3次,觀察大鼠腹壁撤退反射(Abdominal withdraw reflex, AWR)并進行評分。 4.統(tǒng)計分析 實驗過程中連續(xù)記錄神經(jīng)纖維的自發(fā)放電,并以3s為單位用直方圖實時記錄動作電位的放電頻率。在某一特定時間段內(nèi)放電次數(shù)最多的3s期間的放電頻率稱為放電峰值。在化學性刺激時,將加藥后不同時間段放電峰值減去加藥前120s內(nèi)的放電峰值作為統(tǒng)計值,即標準化基礎值(Baseline)為O。觀察不同藥物對腸內(nèi)壓的作用時,采取加入溶劑對照或藥物刺激后120s內(nèi)腸內(nèi)壓平均值減去加藥前120s內(nèi)平均值作為統(tǒng)計值。在機械擴張刺激時,將每升高10cmH2O作為一個區(qū)間,該區(qū)間內(nèi)的腸神經(jīng)放電頻率平均值減去加藥前120s的神經(jīng)放電頻率的平均值作為統(tǒng)計值。觀察藥物對機械擴張刺激的影響時,同時運用Spike2的模板匹配法則進行單根神經(jīng)放電分析。 在對痛覺敏感性的行為學測試中,取每個劑量AWR評分的均值進行統(tǒng)計分析。 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。用One-way ANOVA后Dunnett's檢驗來分析多個實驗組和一個對照組數(shù)據(jù)之間的差異。以P0.05作為顯著性差異的臨界值。n代表每組中動物數(shù)量。 結果： 1.OT對大鼠腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的影響 待神經(jīng)放電穩(wěn)定10min后,向器官浴槽內(nèi)的腸段漿膜面加入10-7M的OT,2min內(nèi)腸系膜傳入神經(jīng)放電頻率并沒有發(fā)生改變,各時間段放電頻率與對照組相比沒有明顯差異(P0.05,n=6)。 2.OT對腸系膜傳入神經(jīng)緩激肽(Bradykinin,BK)敏感性的影響 向器官浴槽中的腸段漿膜面加入OT(10-8M,5×10-8M,10-7M和10-6M)孵育2min后發(fā)現(xiàn),高濃度OT能夠明顯減弱BK誘發(fā)的傳入神經(jīng)放電頻率增加,而低濃度OT則沒有明顯作用,OT的作用表現(xiàn)出濃度依賴性。加入10-7M和10-6M OT后,BK誘發(fā)的放電峰值與對照組(102.4±14.limp s-1)相比分別減少到44.9±6.8imp s-1(10-7M,P0.05,n=6)和33.1士12.2imp s-1(10-6M,尸0.05,,n=6),而低濃度(10-8M和5×10-8M)的OT對BK誘發(fā)的放電增多并沒有顯著作用(P0.05,n=6)。 在器官浴槽中加入OTR阻斷劑atosiban(10-6M)預孵育10min后再加入OT(atosiban+OT+BK組),發(fā)現(xiàn)BK誘發(fā)的放電峰值較Vehicle+OT+BK組提高了118%(P0.05,n=6),提示atosiban減弱OT抑制BK誘發(fā)傳入神經(jīng)放電的作用。 3.OT和BK對腸內(nèi)壓的作用 腸道漿膜面加入OT(10-7M)2min內(nèi),腸內(nèi)壓從1.7±0.2cmH20降低到1.2±0.1cmH20(P0.05,n=6)；BK能也引起平均腸內(nèi)壓下降(P0.05,n=6),所以BK誘發(fā)的神經(jīng)放電增加與腸內(nèi)壓的變化無關。 4.一氧化氮合酶(Nitro oxide synthetase,NOS)阻斷劑對OT作用的影響 為了驗證OT是否通過一氧化氮(Nitro oxide,NO)介導其鎮(zhèn)痛作用,我們觀察了非特異性NOS阻斷劑L-NAME對OT抑制BK誘發(fā)放電的影響。在器官浴槽中加入L-NAME(10-4M)預孵育10min,再依次加入OT和BK后發(fā)現(xiàn)BK誘發(fā)放電峰值較對照組提高了160%(P0.05,n=6)。 5.硝普鈉(Sodium nitroprusside,SNP)對腸系膜傳入神經(jīng)BK敏感性的影響 為了研究NO對腸系膜傳入神經(jīng)BK敏感性的影響,我們向器官浴槽中加入NO供體SNP(4mM)預孵育5min,再加入BK,發(fā)現(xiàn)BK誘發(fā)放電峰值降低到22.8±4.6imp S-1,明顯低于對照組的放電峰值(102.4±14.1imp s-1,尸0.01,n=6). 6.OT在傳入神經(jīng)對機械擴張刺激反應中的作用 通過機械擴張腸段,觀察腸內(nèi)壓逐漸升高60cmH2O的過程中傳入神經(jīng)放電的變化,對41根機械敏感性傳入神經(jīng)進行放電分析。其中12根(29.3%)為低閾值神經(jīng)纖維,腸內(nèi)壓低于20cmH2O時放電頻率達到最高；17根(41.4%)為高閾值神經(jīng)纖維,腸內(nèi)壓升高超過高20cmH2O開始放電,升高60cmH2O放電達最高峰,一般認為這類纖維為脊神經(jīng)中的內(nèi)臟痛覺傳入纖維；其余12根(29.3%)為寬閾值神經(jīng)纖維,在低于20cmH20時放電增加,并在腸內(nèi)壓增高到60cmH2O放電頻率達到最高。OT明顯降低了高閾值神經(jīng)纖維對機械擴張的反應(P0.05)：但對其他種類神經(jīng)纖維沒有影響。 7.OT對CRD誘發(fā)急性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié) 為了進一步檢驗OT對內(nèi)臟痛覺的影響及機制,我們建立了內(nèi)臟高敏感大鼠模型并研究OT對其痛覺敏感性的影響。 腹腔注射OT (1mg kg-1)使大鼠對CRD1.2ml刺激的AWR評分從2.7±0.1顯著降低至1.7±0.2(P=0.004,n=5)；而當CRD壓力增高到1.6ml時,AWR評分從3.3±0.3下降至2±0.3(P0.05,n=5)。用atosiban (0.5mg kg-1,i.p.)預處理后給予OT,CRD壓力為1.2ml的AWR評分較給予OT時提高了82%(P0.05,n=6)。用L-NAME (20mg kg-1,i.p.)預處理再給予OT,也能產(chǎn)生類似atosiban的作用(P0.05,n=7)。 結論： OT降低大鼠空腸腸系膜傳入神經(jīng)對BK和高壓機械刺激的敏感性,下調(diào)內(nèi)臟高敏感大鼠的痛覺,其中對BK敏感性的調(diào)節(jié)是通過激活NOS實現(xiàn)的,提示OT可能是消化道內(nèi)重要的鎮(zhèn)痛物質(zhì)。 第二部分 nNOS-NO-KATp通路在OT抑制正常大鼠腸系膜傳入神經(jīng)對BK敏感性中的作用 目的： 大鼠肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元表達OTR并分泌OT,因此OT是消化道的內(nèi)源性神經(jīng)肽,通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)消化道功能。NO作為一種重要的氣體分子參與外周鎮(zhèn)痛作用,ATP敏感性鉀通道(ATP-activated potassium channel,KATP channel)與NO介導的鎮(zhèn)痛作用有關。OT能夠升高肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度,因此我們推測,OT可能激活肌間神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)元型一氧化氮合酶(Neuronal nitro oxide synthetase,nNOS),通過NO作用于KATP通道抑制腸系膜傳入神經(jīng)的敏感性。本部分就以上假設進行驗證。 方法： 1.腸段準備與離體腸系膜傳入神經(jīng)放電記錄 同第一部分。 2.組織內(nèi)NO檢測 首先制備大鼠空腸縱行肌-肌間神經(jīng)叢(Longitudinal muscle myenteric plexus,LMMP)標本。取大鼠空腸腸段置于鋪有硅膠的操作皿中,持續(xù)通含95%O2和5%CO2的混合氣體,鏡下剝離腸段粘膜層、粘膜下層和環(huán)行肌層,余留的部分即為LMMP標本。每個樣本取LMMP組織0.1g。 將LMMP樣本分為四組,在Krebs液中加入生理鹽水或不同藥物進行孵育分別是生理鹽水(vehicle)、vehicle+OT(10-M)、atosiban(10-6M)+OT(10-7M)、NPLA(10-6M)+OT(10-7M)。先于Krebs液中加入生理鹽水或阻斷劑孵育10min,再加入OT繼續(xù)孵育10min。組織勻漿后在4℃離心10min(2500rpm)。收集上清液,按照NO試劑盒說明配制各試劑及標準品,并進行測定。利用分光光度計在550nm波長處測定OD值,并按公式計算NO含量。 3.熒光NO探針檢測NO LMMP標本用木瓜蛋白酶(10mg ml-1)37℃消化后,Krebs液沖洗,置于含有DAF-FM(10-5M)的HBSS/HEPES混合溶液中37℃孵育1h。而后將LMMP移至加入不同試劑的混合溶液中,分別是生理鹽水、OT(10-7M)或L-NAME(10-4M),孵育10min后再加入OT(10-7M)。沖洗后,4%多聚甲醛固定,75%甘油封片后在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。 4.免疫熒光三重標記 LMMP標本用4%多聚甲醛室溫固定后,PBS洗3次,3%過氧化氫溶液孵育10min以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗3次,10%的驢血清孵育1h以封閉非特異性染色。以上步驟均在室溫進行。分別加入待定位蛋白的一抗混合液4℃孵育12-16h,PBS沖洗3次,加入相應熒光二抗混合液室溫下孵育2h后,75%甘油封片后在共聚焦顯微鏡觀察并拍照。 5.統(tǒng)計分析 同第一部分。 結果： 1. nNOS特異性阻斷劑NPLA對OT作用的影響 在器官浴槽中加入NPLA(10-6M)預孵育10min,再依次加入OT和BK后BK誘發(fā)放電峰值較對照組提高了230%(P0.05,n=6),該結果與第一部分L-NAME的作用類似,說明OT可能主要通過激活nNOS抑制腸系膜傳入神經(jīng)對BK的敏感性。 2.OT對空腸LMMP組織中NO水平的影響 以上實驗表明OT可能通過nNOS增加NO的生成,從而抑制BK誘發(fā)的放電。為驗證該假設,我們進一步采用化學和熒光探針兩種技術檢測OT對LMMP組織內(nèi)NO水平的影響。加入OT(10-7M)孵育10min,空腸LMMP中NO含量較基礎值(3.3±0.6μmol g-1protein)提高了170%(P0.01,n=8),而OTR阻斷劑atosiban(10-6M)或NPLA(10-6M)均可明顯減弱OT的這種作用(P0.05,n=8)。 用NO熒光探針技術發(fā)現(xiàn)在LMMP中NO陽性顆粒主要位于神經(jīng)元的胞體,加入OT(10-7M)孵育10min,LMMP神經(jīng)元上NO熒光強度明顯增高,而經(jīng)阻斷劑L-NAME(10-4M)預孵育后,再加入OT,NO熒光強度較OT組明顯減弱。 3. Calbindin28K、nNOS和OTR在LMMP神經(jīng)元上的表達 在最近的一項研究中我們發(fā)現(xiàn)在肌間神經(jīng)叢的鈣結合蛋白(Calbindin28K)陽性神經(jīng)元上表達OTR,且后者被激活后使鈣離子內(nèi)流增加。由于nNOS的激活依賴鈣離子,結合以上的實驗結果,我們推測OTR可能通過升高細胞內(nèi)鈣離子濃度激活肌間神經(jīng)叢中的nNOS.為了檢驗該假設,我們首先對LMMP上表達Calbindin28K.nNOS和OTR的神經(jīng)元分別進行了計數(shù),發(fā)現(xiàn)其中有74.2%(63/93)calbindin陽性的初級感覺神經(jīng)元同時表達nNOS和OTR。 4.ω-Agatoxin IVA和ω-conotoxin GVIA對OT作用的影響 經(jīng)P型鈣通道特異性阻斷劑ω-Agatoxi IVA(3×10-8M)孵育后加入OT作用2min,發(fā)現(xiàn)BK誘發(fā)的腸系膜傳入神經(jīng)放電峰值由對照組的28.9±10.8imp s-1增高至87.9±7.4imp s-1(P0.05,n=6),說明OT對傳入神經(jīng)BK敏感性的抑制得到部分逆轉；經(jīng)N型鈣通道特異性阻斷劑-conotoxin GVIA(10-7M)孵育后依次加入OT和BK,發(fā)現(xiàn)BK誘發(fā)放電峰值曲50.3士11.9imp s-1增高至106.3±20.3imp s-1(P0.05,n=6),說明OT的作用也部分得到逆轉。 5.格列本脲對OT作用的影響 KATP通道阻斷劑格列本脲(Glibenclamide,10-6M)預孵育10min后,再加入OT,BK誘發(fā)放電峰值較對照組(23.9±11.7imp s-1)有明顯增高(59.1±9.1imp s-1,P0.05,n=6),說明OT對傳入神經(jīng)BK敏感性的抑制可能是通過開放KATP通道實現(xiàn)的。 結論： OT激活腸肌間神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)感覺神經(jīng)元的nNOS,釋放的NO可能作用于傳入神經(jīng)纖維末梢KATP通道,從而降低傳入神經(jīng)對BK的敏感性。 第三部分 OT對TNBS結腸炎模型大鼠腸道局部炎癥和內(nèi)臟痛覺的影響及其機制 目的： 炎癥性腸病(Inflammatoryboweldisease, IBD)是一種腸道慢性復發(fā)性疾病,其發(fā)病機制尚不明確且臨床缺乏有效的治療方法。越來越多的證據(jù)表明免疫系統(tǒng)在IBD的發(fā)病和進展中發(fā)揮了重要作用；肥大細胞參與了包括IBD在內(nèi)的各類炎癥性胃腸疾病的發(fā)病過程；OT除了具有經(jīng)典的生理功能外,還在某些病理條件下發(fā)揮保護作用如促進胃潰瘍愈合、提高缺血性皮瓣的存活率等,并且OT類似物可抑制小鼠腸道高敏感；在小鼠腹腔和子宮的肥大細胞上均有OTR表達,因此我們假設OT可能通過抑制腸道肥大細胞的脫顆粒抑制TNBS誘發(fā)的腸道炎癥反應和內(nèi)臟高敏感性。 方法： 1. TNBS誘導腸炎模型建立與分組 采用Morris等報道的2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘導結腸炎改良技術,將5%TNBS0.6ml溶于無水乙醇0.2m1(后者用于破壞粘膜屏障)備用,相當于30mg TNBS溶于25%(v/v)酒精。大鼠灌腸實驗前一天16：00pm開始禁食自由禁水,次日8：00開始灌腸。灌腸前輕揉大鼠腹部,使其盡可能排盡殘余糞便。腹腔注射10%水合氯醛(0.3g kg-1),待大鼠麻醉后,將聚乙烯導管輕柔經(jīng)肛門送入腸道,至導管前端距肛門約8cm處。分別抽取生理鹽水或配好的TNBS溶液通過導管緩慢注入至結腸腸管內(nèi)。使大鼠頭部向下,維持大鼠倒立狀態(tài)10min,以防藥物反流。觀察其生命體征無異常后,放入飼養(yǎng)籠內(nèi),灌腸后4h進行喂食,不限制飲水。 1.1在研究OT對結腸局部炎癥作用的實驗中,將實驗動物隨機分為3組： (1) Control組,生理鹽水灌腸。生理鹽水灌腸后第1天開始每天給予生理鹽水灌腸至第7天。 (2) TNBS+Saline組,TNBS灌腸后第1天開始每天給予生理鹽水灌腸至第7天。 (3) TNBS+OT組,TNBS灌腸后第1天開始每天給予OT灌腸(1mg kg-1)至第7天。 1.2在研究炎癥對大鼠內(nèi)臟敏感性影響的實驗中,將實驗動物隨機分為2組： (1) Vehicle組,生理鹽水灌腸。 (2) TNBS組,TNBS灌腸。 1.3在研究OT對腸炎模型大鼠內(nèi)臟敏感性影響的實驗中,將實驗動物隨機分為3組： (1) Control組,TNBS灌腸后第1天開始每天給予生理鹽水灌腸至第7天。 (2) Vehicle+OT組,TNBS灌腸后第1天開始每天先給予生理鹽水灌腸,30min后給予OT (1mg kg-1)灌腸至第7天。 (3) Atosiban+OT組,TNBS灌腸后第1天開始每天先給予atosiban(0.5mg kg-1),30min后給予OT(1mg kg-1)灌腸至第7天。 2.一般情況觀察 大鼠灌腸實驗后,每天觀察大鼠的一般狀況,包括精神、活動、飲食、毛發(fā)光澤、大便性狀等。分別稱量大鼠灌腸前和灌腸后第7天的體重并進行比較。鏡下檢測大便紅細胞數(shù)時,高倍鏡下(×400)視野內(nèi)紅細胞數(shù)10者為陽性。 3.結腸粘連程度及炎癥損傷的宏觀形態(tài)評價 結腸與周圍組織粘連評分：大鼠灌腸后第7天,給藥后2h以2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后,處死動物,作腹正中剖開術,觀察結腸與周圍組織粘連情況。 肉眼觀察炎癥損傷宏觀形態(tài)評分：觀察結腸與周圍組織粘連情況后,取出距肛門8cm處至肛門之間的結腸組織,沿腸系膜剖開,粘膜面向上平鋪固定。肉眼觀察結腸損傷的嚴重程度并拍照,進行評分。 測量結腸重量：肉眼觀察結腸損傷嚴重程度后,稱量記錄結腸組織濕重。 4.HE染色及炎癥損傷的組織形態(tài)學評分 在距肛門2.5cm、5cm及7.5cm處取結腸組織,10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)4μm切片,常規(guī)HE染色。每個組織塊選取3張切片,每張切片隨機選取3個視野,觀察炎癥浸潤,壞死及再生程度。對腸道炎癥程度進行評分,各視野評分的平均值為該組織最終炎癥評分。 5.髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 稱量結腸組織濕重,制備5%組織勻漿,不離心。將組織勻漿按照MPO試劑盒說明書加樣,取出后立即在460nm處測吸光度,而推算MPO活性。 6.肥大細胞甲苯胺藍染色 結腸粘膜肥大細胞染色采用甲苯胺藍改良染色法。石蠟切片經(jīng)0.5%甲苯胺藍溶液染色20min后蒸餾水漂洗,用0.5%冰醋酸分色1min至肥大細胞顆粒呈紫色。蒸餾水漂洗后吹干,中性樹膠封片。置于鏡下觀察并拍照,每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)肥大細胞數(shù)量的總和作為統(tǒng)計值。 7.OTR免疫組織化學染色 石蠟切片滴加羊抗大鼠OTR一抗,4℃孵育過夜,滴加二抗,DAB顯色,中性樹脂膠封片。顯微鏡下觀察拍照并進行分析。8.OT的檢測 每只大鼠取0.1g遠端結腸,0.1M PBS沖洗。加入1ml0.1M PBS制備勻漿,然后置于-20℃過夜,反復凍融2次,將組織勻漿于2-8℃5000g離心5min取上清液。用大鼠OT試劑盒按照說明書進行測定。 9.痛覺敏感性的行為學測試 同第一部分。 10.組胺的檢測 根據(jù)之前報道的方法檢測結腸自發(fā)釋放的組胺濃度。取約0.1g結腸組織置于含有2ml Hanks液中,持續(xù)通95%O2/5%CO2,維持37℃。孵育25min后,吸出200μl移至95℃加熱7min,以防止組胺酶快速變性；離心后吸取清液備用；最后稱量組織干重；利用大鼠組胺高選擇性酶聯(lián)免疫試劑盒測定上清液中組胺含量。 11.統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。用One-way ANOVA后Dunnett's檢驗來分析多個實驗組和一個對照組數(shù)據(jù)之間的差異。以P0.05作為顯著性差異的臨界值。n代表每組中樣本數(shù)量。 結果： 1.OT對結腸炎模型大鼠一般情況的影響 在制作模型期間,Control組大鼠活潑,毛發(fā)有光澤,大便成形,潛血陰性,體重增加。TNBS+Saline組大鼠第3天時大便頻率開始增加,大便不成形或稀便,精神萎靡、豎毛、懶動、厭食,第7天時大鼠出現(xiàn)大便鏡下紅細胞陽性或肉眼血便,大多數(shù)大鼠肛門粘有糞便,偶見血便。大鼠體重增加量從47.7g±5.7g(Control組,n=7)明顯減少至25.7g±6.7g(TNBS+Saline組,P0.05,n=9)。TNBS灌腸后連續(xù)7天進行OT(1mg kg-1)灌腸,發(fā)現(xiàn)OT能明顯改善上述癥狀,大鼠大便可成形,第7天時僅少數(shù)大鼠出現(xiàn)大便紅細胞陽性,并無肉眼血便,灌腸7天后大鼠體重增加量也較TNBS+Saline組提高了40.6%。 2.OT對結腸粘連程度、宏觀形態(tài)和結腸濕重的影響 灌腸后第7天,Control組大鼠結腸沒有發(fā)生粘連,而在大多數(shù)TNBS+Saline組大鼠中出現(xiàn)結腸漿膜與鄰近器官發(fā)生多處粘連,TNBS+Saline組結腸的粘連程度評分明顯高于Control組大鼠(P0.05),而TNBS+OT組粘連程度評分較TNBS+Saline組有所下降(P0.05)。 肉眼觀察大鼠結腸粘膜變化發(fā)現(xiàn),Control組大鼠粘膜完整光滑、無潰瘍；TNBS+Saline組結腸粘膜充血水腫,有潰瘍形成,病變部位發(fā)生狹窄；TNBS+OT組中的結腸粘膜潰瘍面積明顯減小。造模后第7天TNBS+Saline組的結腸宏觀損傷評分顯著高于Control組(P0.05),當連續(xù)給予OT灌腸7天后,宏觀損傷評分與TNBS+Saline組相比明顯下降(P0.05)。 ·稱量結腸濕重可以作為炎性水腫、腸壁增厚的間接指標。TNBS+Saline組大鼠結腸段濕重與Control組(0.5±0.04g)相比,顯著增加(1.3±0.3g,P0.05)；TNBS+OT組的結腸濕重則降低至0.9±0.3g(P0.05)。 3.OT對結腸組織形態(tài)學表現(xiàn)的影響 造模后第7天取結腸組織做石蠟切片HE染色,觀察結腸局部炎癥的組織形態(tài)學表現(xiàn)。TNBS誘導結腸炎癥表現(xiàn)為粘膜腺體排列變形、水腫,可見上皮剝落、炎性滲出物,主要表現(xiàn)為中性粒細胞浸潤、壞死和再生。TNBS+Saline組與Control組相比炎癥組織學表現(xiàn)顯著,形態(tài)學評分由0.28±0.1顯著增高至6.8±0.7(P0.01,n=9),而給予OT處理后與TNBS+Saline組相比結腸組織炎癥表現(xiàn)明顯減輕,形態(tài)學評分降低(P0.05,n=9)。 4.OT對結腸組織內(nèi)MPO活性的影響 用生理鹽水或TNBS灌腸后第7天,對結腸組織MPO活性進行了檢測。TNBS+Saline組大鼠結腸組織的MPO活性比Control組明顯增高(P0.05,n=9)。經(jīng)OT連續(xù)灌腸7天后,結腸組織的MPO活性比TNBS+Saline組顯著降低(P0.05,n=9)。 5.OTR在結腸粘膜肥大細胞的表達及炎癥對OT表達的影響 通過在結腸標本同一部位相鄰的石蠟切片上分別用甲苯胺藍染色和免疫組化方法標記腸粘膜肥大細胞和OTR。結果顯示,用甲苯胺藍標記肥大細胞的部位同時發(fā)現(xiàn)有OTR免疫陽性神經(jīng)元,并且當用同一切片先用免疫組化染色標記OTR而后用甲苯胺藍標記的切片上發(fā)現(xiàn)部分甲苯胺藍標記上肥大細胞上表達OTR,說明消化道肥大細胞上表達OTR。 OT和OTR在整個胃腸道中都有表達,所以OT可能通過自分泌途徑來減輕炎癥反應。TNBS灌腸后第7天,TNBS組結腸局部OT濃度較Vehicle組明顯增加,說明急性炎癥時腸道內(nèi)源性OT信號系統(tǒng)被激活。 6. TNBS對大鼠腸道后內(nèi)臟敏感性的改變及OT對結腸炎內(nèi)臟高敏感的影響。 首先采用梯度式CRD技術觀察TNBS誘導的大鼠結腸炎后腸道感覺敏感性的變化。TNBS灌腸后第7天,行梯度式CRD。當向氣囊內(nèi)注射0.8ml水時,TNBS模型組的AWR評分與Vehicle組評分相比增高了47.1%(P0.05,n=6)；當注射1.2ml或1.6ml水時,TNBS組評分比Control組分別增高了29.6%和29.1%(P0.05,n=6)。 之后觀察了OT是否影響TNBS腸炎大鼠對梯度式CRD刺激的AWR評分。當分別注射0.8ml,1.2ml(?)1.6ml水時,經(jīng)OT處理后的大鼠與模型大鼠相比AWR評分明顯降低(P0.05,n=6)。經(jīng)OTR阻斷劑atosiban(0.5mg kg-1)預處理后行OT灌腸組的AWR評分分別增長66.7%(1.2m1)和60%(1.6ml),明顯高于Vehicle+OT組(P0.05,n=6)。 7.OT對結腸粘膜肥大細胞數(shù)量和組胺釋放的影響 在高倍鏡下可觀察到經(jīng)甲苯胺藍染色后的肥大細胞顆粒呈藍紫色；發(fā)生脫顆粒時藍紫色顆粒從細胞內(nèi)釋放至細胞外周。TNBS灌腸后第7天,TNBS+Saline組(n=9)結腸粘膜中甲苯胺藍染色陽性的肥大細胞數(shù)量與Control組相比顯著降低(P0.05,n=7)。經(jīng)OT灌腸處理后,發(fā)現(xiàn)腸炎模型大鼠(TNBS+OT組)中粘膜肥大細胞的數(shù)量有所增加(P0.05,n=9)。 組胺可以作為肥大細胞脫顆粒的特異性標記物。通過酶聯(lián)免疫法檢測組胺釋放量,結果發(fā)現(xiàn)TNBS+Saline組(n=9)大鼠結腸釋放的組胺濃度比Control組(n=7)增加了44%(P0.05)；而給予OT處理后炎癥結腸組織組胺的釋放量與TNBS+Saline組相比降低了30.7%(P0.05,n=9)。 結論： 1.結腸粘膜肥大細胞上有OTR的表達,同時TNBS誘發(fā)腸道局部OT濃度增高,說明OT作為腸道的內(nèi)源性神經(jīng)肽,參與并調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程。 2.外源性OT抑制TNBS誘發(fā)的腸道炎癥、結腸高敏感性和肥大細胞脫顆粒,說明抑制肥大細胞脫顆�？赡苁荗T抑制大鼠腸道炎癥和內(nèi)臟高敏感的重要機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻】

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1 周四元,梅其炳,劉莉,郭欣,邱博生,趙德化,曹之a(chǎn)，

本文編號：2070848