本文選題：真皮乳頭細胞 + 毛發(fā)誘導(dǎo)能力��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：背景毛囊是由上皮部分和真皮部分組成,這兩種成分的細胞的相互作用在毛囊的形成與生長中發(fā)揮著重要的作用。毛囊的上皮細胞與真皮細胞之間的復(fù)雜的交流與作用被認為是促進毛囊再生及維持毛囊正常發(fā)育生長的關(guān)鍵因素。雖然毛囊的形成涉及到這兩種細胞發(fā)出的一系列復(fù)雜并相互影響的信號,但一般來說,真皮部分的細胞被認為是引導(dǎo)者,而毛囊上皮細胞被認為是應(yīng)答者。毛囊上皮部分包括外根鞘、內(nèi)根鞘、毛母質(zhì)和毛干,這些上皮成分均由位于毛囊隆凸部位的上皮干細胞產(chǎn)生。毛母質(zhì)內(nèi)的角質(zhì)形成細胞被稱為是“毛干的生長工廠”,這些角質(zhì)細胞具有短暫快速增殖的能力,它們受毛囊內(nèi)真皮乳頭細胞釋放的一系列信號因子的刺激,可快速增殖并分化為毛干等結(jié)構(gòu)。毛囊真皮部分又被分為真皮乳頭和真皮鞘。真皮乳頭位于毛囊的底部,與周圍的毛母質(zhì)上皮部分相鄰,被真皮鞘環(huán)繞包裹,僅通過基底的莖突與真皮鞘相連。真皮乳頭內(nèi)儲存有大量毛乳頭細胞,真皮乳頭細胞分泌一系列細胞因子來影響與其相鄰毛母質(zhì)內(nèi)角質(zhì)上皮細胞的增殖及分化,繼而影響毛囊生長并調(diào)控毛囊的生長周期。因此真皮乳頭細胞在毛囊的生長中發(fā)揮著核心的調(diào)控作用。由于真皮乳頭細胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力對于毛囊再生與生長至關(guān)重要,因此模擬細胞外環(huán)境以保留甚至恢復(fù)真皮乳頭細胞誘導(dǎo)能力的模型日益得到人們的重視,這些模型主要分為體內(nèi)毛囊重建模型和體外毛囊培養(yǎng)模型。體內(nèi)動物模型又包括注射法、小室法和皮瓣法,總的原理是將真皮乳頭細胞和上皮干細胞相混合,再用不同方法移植入裸鼠體內(nèi),觀察體內(nèi)毛囊重建與生長情況,從而模仿了真皮乳頭細胞誘導(dǎo)毛囊再生所需的體內(nèi)環(huán)境。但無論是注射法、小室法和皮瓣法均有各自的缺陷,使真皮乳頭細胞的誘導(dǎo)能力受到了一定程度的損害并繼而影響毛囊的重建。小室法是在裸鼠背部創(chuàng)造一個肉芽創(chuàng)面,然后將乳鼠上皮細胞與真皮細胞的混合物放入該創(chuàng)面上,大約在23天后可明顯看到毛干長出,毛發(fā)質(zhì)量和密度與正常無異常。雖然小室法產(chǎn)生的毛囊形態(tài)最佳,但是這種模型耗費的細胞數(shù)量最多,而且操作相對復(fù)雜。皮瓣法能產(chǎn)生與小室法類似的毛發(fā)效果,如毛干質(zhì)量與密度,但是最早至少需要29天才能產(chǎn)生毛囊,這種方法需要的細胞量比小室法要少,但是需要行兩次外科手術(shù)治療,動物失血較多。注射法產(chǎn)生數(shù)量最少的毛發(fā),這是因為,不像前兩種方法,小室法將細胞混合物被放入解剖位置不正常的部位,即真皮致密層,形成大小不等的囊狀物,這些囊狀物容易破裂并導(dǎo)致排斥反應(yīng),大多數(shù)最終纖維化,很少有毛發(fā)長出。盡管如此,這種方法的優(yōu)點在于它需要的細胞量最少,并且省力省時,容易快速產(chǎn)生少量毛囊。體內(nèi)模型雖然可在體內(nèi)原位研究毛囊,并且可用具體形態(tài)觀察、免疫組織化學、來觀察毛囊變化,但是難以對單個毛囊的體外壞境予以精確控制,從而難以準確闡述單個細胞因子在毛囊生長中所起的作用。細胞培養(yǎng)包括分離和培養(yǎng)單種細胞群,使細胞的形態(tài)、生化和分子參數(shù)可以被測量,然而細胞培養(yǎng)導(dǎo)致毛囊組織三維立體結(jié)構(gòu)的喪失,使細胞培養(yǎng)不能準確地反映出整個器官的真實情況。毛囊器官培養(yǎng)彌補了細胞培養(yǎng)的缺點,同時保留了組織的完整結(jié)構(gòu)。完整毛囊的器官培養(yǎng)能最大限度地模仿毛囊真皮乳頭細胞的生態(tài)壞境及真皮乳頭立體結(jié)構(gòu),從而在一定程度上保留了真皮乳頭細胞的誘導(dǎo)能力。利用毛囊器官培養(yǎng)模型,我們可以準確檢測外界不同藥物或生長因子對真皮乳頭細胞的影響。但目前毛囊器官培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基尚不能完全模仿體內(nèi)環(huán)境,與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)相比,雖然器官培養(yǎng)的毛囊內(nèi)真皮乳頭細胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力得到了一定程度的保留,但仍然在培養(yǎng)中不斷喪失,影響了毛囊的生長。本研究擬從兩方面進行研究,一是改良將真皮乳頭細胞移植入動物體內(nèi)的實驗?zāi)Ｐ?從而為真皮乳頭細胞盡可能提供良好的體內(nèi)環(huán)境,以促進毛囊的重建與生長；二是改良毛囊體外培養(yǎng)所需的環(huán)境,即培養(yǎng)基,使毛囊內(nèi)的真皮乳頭細胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力盡可能得到保留。該研究結(jié)果對于毛發(fā)體內(nèi)再生重建和治療各類毛發(fā)生長缺陷性疾病提供了重要的理論和臨床實際意義。目的1設(shè)計一種更簡便、更有效的動物模型,使移植入動物體內(nèi)的真皮乳頭細胞的誘導(dǎo)能力得到最大限度的保留,從而促進體內(nèi)毛囊重建。2改良毛囊器官培養(yǎng)的外壞境,即培養(yǎng)基,以恢復(fù)毛囊真皮乳頭細胞的部分誘導(dǎo)能力,從而使體外培養(yǎng)的毛囊的增殖期延長。方法1.裸鼠體內(nèi)毛囊重建模型的改良1.1毛囊上皮組織與毛囊真皮細胞的制備：將出生24小時內(nèi)的C57BL/6J小鼠處死,用75%酒精浸泡消毒后取其背部全層皮膚,然后用PBS液反復(fù)潤洗,去除多余脂肪,放入含1%中性蛋白酶的DMEM消化液中,在4℃下消化過夜。次日將已消化過夜的皮膚取出,用鑷子可輕易分離上皮與真皮組織。將完整的上皮片臨時放入含10%小牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培養(yǎng)液(DMEM/10)的培養(yǎng)皿中待用。用顯微剪反復(fù)地將真皮組織剪成細小顆粒狀,然后放入0.2%膠原酶中在37℃下消化1小時。消化結(jié)束后,加入等量的DMEM/10,然后依次用100微米和40微米的細胞濾網(wǎng)過濾,將所得的細胞懸液在200g下離心5分鐘,再將細胞沉淀塊重新懸浮于1毫升的DMEM/10液體中并計數(shù)。最后再次將細胞懸液離心并懸浮于20微升的DMEM/10中,使成泥漿狀。1.2設(shè)計改良皮瓣法動物模型：將1.5毫升離心管蓋子取下,修剪成一個約1.5cm2大小的圓形硅膠板。將制備的上皮片角質(zhì)層覆蓋在硅膠板的光滑面,使真皮面朝上。用微型吸管將泥漿樣的真皮懸液涂抹于上皮片的真皮面。將載有上皮片及真皮細胞的硅膠板放于37-℃的CO2孵箱中,蒸發(fā)掉多余的水分。將4-5周大的裸鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥液麻醉,背部用0.5%聚維酮碘液消毒。在背部近臀部設(shè)計一切口線,切開皮膚潛行分離皮下,使行成一個能容納假體的空間,將載有上皮片及真皮細胞的硅膠板移植入已分離的皮下,再將切口縫合。1.3為進行對比,我們同時進行了傳統(tǒng)皮瓣法的實驗?zāi)Ｐ?在裸鼠背部行三邊切口(約0.8×1 cm),掀起整個皮膚層,植入一個載有上皮片及真皮細胞的薄層軟硅膠片(約2.5×.5 cm),上皮片的真皮面同樣朝上,其余步驟同改良皮瓣法。1.4打開皮瓣觀察毛發(fā)生長情況：當背部皮膚明顯隆起并且顏色變黑時,我們設(shè)計三邊切口,切開皮膚打開皮瓣,向后翻轉(zhuǎn)使其暴露在外界環(huán)境中,再拉攏周圍的切口并間斷縫合以閉合創(chuàng)面。1.5移植細胞的追蹤： 為評估移植入裸鼠體內(nèi)的上皮細胞,我們選擇用GFP轉(zhuǎn)基因的C57BL/6J小鼠的背部上皮細胞片。為追蹤真皮細胞,我們用dilinoleyltetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil),一種橙紅色細胞膜熒光染料,來對真皮細胞進行染色,再將其移植入裸鼠體內(nèi)。GFP上皮片與普通乳鼠真皮細胞混合后移植,Dil染色的真皮細胞與普通乳鼠來源的上皮細胞片混合移植。1.6毛發(fā)生長的評估：毛發(fā)生長的評估分別通過外觀和組織學(HE染色石蠟切片及電鏡檢查)來觀察。2.毛囊器官培養(yǎng)液的改良—溶菌酶在毛囊中的表達及對毛囊體外生長的影響2.1毛囊生長周期中的溶菌酶表達變化：分別將處于增殖期和衰退期的毛囊用4%多聚甲醛固定,然后用石蠟包埋、切片(厚度4gm),抗原還原處理后,分別用溶菌酶一抗(兔來源抗鼠,貨號：SAB 1306215,1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和相應(yīng)第二抗體處理組織切片。然后DAB加蘇木精染色顯色。2.2毛囊體外培養(yǎng)：選擇4-5周大的C57BL/6J小鼠,從其觸須墊部位顯微分離出觸須毛囊,從中選擇處于增殖期的毛囊并將其放入24孔細胞培養(yǎng)板中進行培養(yǎng),培養(yǎng)基包括500μ1 Williams E培養(yǎng)液,濃度為2 mM L-谷氨酰胺,10 mg/ml的胰島素,10g/ml的氫化可的松和經(jīng)稀釋100倍的青霉素與鏈霉素雙抗液。每次試驗將40根毛囊平均分成4組,分別加入溶菌酶1,5,10 μg/ml或者不加溶菌酶。試驗共重復(fù)3次。2.3毛囊的毛干增加長度與生長周期的測量：我們使用倒置顯微鏡(IX71；Olympus Optical Co.Ltd, Tokyo,Japan)分別在第0,1和3天拍照,觀察毛囊生長周期的變化。2.4 Ki-67 and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)雙熒光染色：為了追蹤毛囊內(nèi)上皮干細胞的增殖情況,我們在毛囊體外培養(yǎng)結(jié)束前12小時在培養(yǎng)基中加入10 μM的BrdU。培養(yǎng)結(jié)束后我們挑選出仍處于增殖期的毛囊,放入4%多聚甲醛中固定24小時,石蠟包埋,切成4μm厚的薄片,經(jīng)抗原修復(fù)后,在4℃下用抗BrdU和Ki-67的混合一抗(兔抗小鼠Ki-67,貨號：AB9260,1:1000;Millipore, Bedford, MA,USA和大鼠抗小鼠BrdU,貨號：ab6326,1:100;Abcam, Cambridge, MA,USA)孵育組織切片。接下來用相應(yīng)熒光二抗處理組織切片。細胞核再用4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)復(fù)染。2.5毛乳頭細胞培養(yǎng)：毛乳頭從C57BL/6J鼠觸須毛囊的毛球部分離獲得,再將毛乳頭放入含4型膠原酶的培養(yǎng)皿中消化3小時,然后放入含100 U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和20%小牛血清的DMEM中,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取出的毛乳頭共培養(yǎng)5天,每3天換一次培養(yǎng)液。當細胞在培養(yǎng)皿中生長接近至融合狀態(tài)時,將其以1：3的比例進行傳代。獲得的毛乳頭細胞暫放入DMEM/10液中等待下一步使用。2.6蛋白免疫印跡法：將培養(yǎng)2代的毛乳頭細胞用5和10μg/ml的溶菌酶處理24小時,然后用RIPA裂解液提取所有蛋白,然后使用10%SDS-PAGE將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,將膜分別用一抗在4℃下孵育過夜。一抗包括：兔抗小鼠LEF1,貨號：ab85052,1:400;Abcam).兔抗小鼠堿性磷酸酶(ALP),貨號：sc-30203,1:1000;SantaCruz Biotechnology),和兔抗小鼠β-actin(ab8227, 1:1000;Abcam)。然后將膜用對應(yīng)的二抗在室溫下孵育1小時。免疫復(fù)合物用免疫印跡增強化學發(fā)光試劑盒檢測。實驗重復(fù)3次,用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Silver Spring, MD, USA)對條帶光密度值進行分析。3.統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示(x±SEM)。對于動物體內(nèi)實驗,兩組間數(shù)據(jù)比較采用unpaired t-test。對于毛囊器官培養(yǎng)的數(shù)據(jù)分析,多組之間的數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA分析,先檢驗方差是否相齊,若方差相齊,兩兩比較用Bonferroni test分析,方差不齊則應(yīng)用welch分析。P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.與傳統(tǒng)皮瓣法相比,經(jīng)過我們改良的皮瓣法操作步驟更為簡化,動物在術(shù)中失血更少,術(shù)后不僅能產(chǎn)生正常形態(tài)和密度的毛發(fā),而且能明顯縮短真皮乳頭細胞在體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊重建所需的時間。2.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶主要表達在增殖期毛囊的真皮部位(真皮乳頭和真皮鞘),而在衰退期的表達明顯減弱,不僅如此,在器官培養(yǎng)液中加入適量的溶菌酶,能明顯恢復(fù)真皮乳頭細胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力,從而延長毛囊的增殖期,促進毛囊毛干的生長。結(jié)論1.本研究通過改良皮瓣法模型,改善了移植入體內(nèi)的真皮乳頭細胞的生長環(huán)境,提高了其毛發(fā)誘導(dǎo)能力,使毛發(fā)的形成時間大大縮短。2.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶具有促進毛囊在體外生長的能力。3.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶可恢復(fù)培養(yǎng)的真皮乳頭細胞的部分毛發(fā)誘導(dǎo)性,從而促進毛囊在體外的生長。
[Abstract]:background hair follicles are composed of epithelial and dermal parts which play an important role in the formation and growth of hair follicles . The dermal papilla cells are divided into dermal papilla cells and dermal sheaths . The present study intends to study the effect of different drugs or growth factors on dermal papilla cells .
A simple and effective animal model was designed to remove excess fat , and then put into DMEM / 10 medium containing 1 % neutral protease . In order to evaluate the growth of hair follicles , we studied the expression of lysozyme in the hair follicle and then transplanted them into nude mice .
The cells were incubated at 37 鈩，

本文編號：2045500