本文選題：基因表達載體 + 轉(zhuǎn)染�。� 參考：《福建中醫(yī)藥大學》2014年碩士論文

【摘要】：第一章：A20基因表達載體的構(gòu)建、質(zhì)粒的提取及體外鑒定 目的：1、構(gòu)建一種攜帶A20基因的表達載體。2、培養(yǎng)大腸桿菌,提取高濃度、高純度的質(zhì)粒DNA。3、質(zhì)粒DNA的體外鑒定。 方法：1、構(gòu)建成A20的基因表達載體pcDNA3.1-A20,并將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中,用空質(zhì)粒載體pcDNA3.1作為對照,-20℃保存?zhèn)溆谩?、大腸桿菌采用固體LB培養(yǎng)基劃盤,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16h,挑取單菌落,接種于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,置37℃恒溫搖床,轉(zhuǎn)速210r/min,培養(yǎng)12-16h,提取質(zhì)粒DNA,測定其濃度,并對其進行1%瓊脂糖凝膠電泳,以確定是目的基因。3、重組質(zhì)粒DNA經(jīng)過體外細胞轉(zhuǎn)染,熒光倒置顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染的表達情況。 結(jié)果：1、經(jīng)過酶切、提取、電泳鑒定后結(jié)果完全正確。2、體外轉(zhuǎn)染HK-2細胞,有綠色熒光表達的細胞為轉(zhuǎn)染細胞。 結(jié)論：體外實驗證實A20基因表達載體可有效轉(zhuǎn)染HK-2細胞。 第二章：銀杏葉提取物與轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)A20過表達在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用 目的：1、建立一種穩(wěn)定、可靠的大鼠腎缺血再灌注損傷模型。2、觀察銀杏葉提取物及轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)A20過表達對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用,為臨床防治腎IRJ提供實驗性理論依據(jù)。 方法：1、雄性SD大鼠,體重250-280g,用50mg/kg體重戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,打開腹腔,分離左腎動脈和靜脈,微型血管夾夾閉左腎動靜脈45min,夾閉期間行右腎切除術(shù)。45min后松開血管夾,觀察大鼠左側(cè)。腎臟血管再灌注情況并縫合腹部切口。制成大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2、技術(shù)熟練后,行大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型制作。實驗大鼠隨機分四組：分別為生理鹽水組、A20組、銀杏葉組、A20+銀杏葉組,每組8只大鼠。術(shù)前48小時對生理鹽水組、A20組、A20+銀杏葉組,分別通過尾靜脈注射生理鹽水、脂質(zhì)體pcDNA3.1-A20+生理鹽水250μl(15μl脂質(zhì)體加10μg構(gòu)建的質(zhì)粒DNA混勻后加入生理鹽水至250μ1),銀杏葉組和A20+銀杏葉組于術(shù)前30min腹腔注射銀杏葉提取物50mg/kg。手術(shù)后24h收獲大鼠,分別由下腔靜脈采血5ml,取左側(cè)腎臟,腎臟組織分三部分,1/3置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定,待作組織學檢查,另2/3組織分兩部分,速凍于液氮并轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱保存,行相關(guān)檢測。血清采用全自動生化分析儀檢測Scr.BUN,腎組織HE染色行病理學檢測,TUNEL法檢測腎小管上皮細胞的凋亡情況,Western blot法檢測A20蛋白的表達,RT-PCR檢測A20mRNA水平的表達,EMSA檢測NF-kB的活性。 結(jié)果：1、經(jīng)過練習,建立了比較穩(wěn)定的大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。手術(shù)成功率可達95%。2、A20組和A20+銀杏葉組血清Scr、BUN水平明顯低于其余各組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。A20+銀杏葉組與A20組比較,差異有統(tǒng)計學意義；各組腎小管都有不同程度的損傷,銀杏葉組、A20+銀杏葉組以腎小管上皮細胞刷狀緣損傷為主,與生理鹽水組比較,腎組織病理損傷明顯減輕(p均0.05)。A20組與生理鹽水組比較,腎小管擴張,腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、壞死,蛋白管型等腎臟組織病理損傷減輕,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；腎小管上皮細胞凋亡多見于遠端小管,與生理鹽水組比較,各組凋亡細胞數(shù)均明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);銀杏葉組和A20+銀杏葉組與A20組比較,凋亡細胞數(shù)明顯減少(P均0.05)；各組A20蛋白及mRNA水平表達均有所升高,與生理鹽水組比較,A20組與A20+銀杏葉組升高更明顯,差異有統(tǒng)計學意義(p均0.05)；各組NF-kB的活性均不同程度受抑制,與生理鹽水組比較,A20組與A20+銀杏葉組中,NF-kB活性受抑制更明顯。 結(jié)論：銀杏葉提取物與轉(zhuǎn)基因方法均能上調(diào)A20基因在體內(nèi)的表達,改善腎功能,減輕腎IRI的病理損害及腎小管上皮細胞凋亡,從而達到腎臟保護作用,且二者合用效果較為突出,其機制可能與A20抑制腎小管上皮細胞凋亡,通過負反饋抑制NF-kB信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用有關(guān)。
[Abstract]:Chapter 1 : Construction of Gene Expression Vector , Extraction of Plasmid and In Vitro Identification

Objective : 1 . To construct an expression vector carrying the gene of 20 . 2 . To culture E . coli , to extract plasmid DNA with high concentration and high purity . The in vitro identification of plasmid DNA was carried out .

Methods : 1 . The gene expression vector pcDNA3.1 - 20 was constructed , and the plasmid with the target gene was transformed into competent E . coli . The plasmid pcDNA was used as the control . The plasmid pcDNA was used as the control . The plasmid pcDNA was incubated at 37 鈩，

本文編號：1990326