本文選題：淫羊藿苷 + 糖皮質(zhì)激素　； 參考：《廣東藥學(xué)院》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫病，臨床特點(diǎn)為癥狀體征的空間多發(fā)性和病程的時(shí)間多發(fā)性。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前公認(rèn)研究MS的動(dòng)物模型，常用于該病機(jī)制和藥物治療作用的研究。目前針對(duì)該病仍無(wú)特效的治療方法，較公認(rèn)的觀點(diǎn)是以大劑量糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid,GC）沖擊治療為主，但近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)激素沖擊后存在一系列嚴(yán)重副反應(yīng)如嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松、肥胖以及一系列精神障礙性疾病等。隨著雌激素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的保護(hù)性作用逐漸被人熟知，并對(duì)此進(jìn)行大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了雌激素對(duì)EAE的發(fā)病存在明顯保護(hù)作用，但考慮到誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)而存在爭(zhēng)議。因此，植物雌激素--一種既有擬雌激素效應(yīng)又能對(duì)體內(nèi)雌激素水平進(jìn)行調(diào)控效應(yīng)的藥物引起了人們的極大的興趣。淫羊藿作為植物雌激素的一種，近來被廣泛研究用于骨代謝及心血管有關(guān)疾病的研究中，均取得頗為滿意的結(jié)果。我們前期有關(guān)EAE的研究中淫羊藿苷（淫羊藿的效應(yīng)單體,icraiin,ICA）對(duì)EAE發(fā)病的治療作用進(jìn)行了探索，結(jié)果已經(jīng)證實(shí)ICA通過擬雌激素效應(yīng)對(duì)EAE具有保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)GC具有正性調(diào)節(jié)作用。本課題擬聯(lián)合使用具有擬雌激素效應(yīng)的ICA和外源性GC-甲基潑尼松龍（methylprednisolone,MP）治療EAE，探索兩者是否有協(xié)同作用及其機(jī)制。 研究目的 在前期研究的基礎(chǔ)上，以C57BL/6雌性小鼠作為構(gòu)建EAE模型，給予ICA和MP聯(lián)合治療，從臨床評(píng)分、免疫相關(guān)因子水平、有關(guān)受體蛋白水平、脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平及組織病理等方面觀察兩者聯(lián)合使用后對(duì)EAE的保護(hù)作用，初步探討其相互作用的機(jī)制及對(duì)HPA軸的影響。 研究方法 1、構(gòu)建EAE模型 C57BL/6雌性小鼠構(gòu)建EAE模型。將鼠源MOG35-55多肽與等體積CFA混合制成抗原乳劑，皮內(nèi)注射于小鼠脊柱兩旁（分四點(diǎn)，每個(gè)部位50μL），于免疫后第7d加強(qiáng)免疫1次（等劑量MOG及CFA）。在免疫后第0及第48h內(nèi)腹腔內(nèi)注射500ng百日咳毒素，免疫后每日進(jìn)行觀察，稱重及發(fā)病后的評(píng)分。 2、EAE模型鼠鑒定 ①臨床表現(xiàn)：對(duì)神經(jīng)損害表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分。于免疫第8天開始陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)出EAE癥狀，第13天達(dá)到高峰。 ②脊髓組織病理：取腰膨大處脊髓組織于4%多聚甲醛液中固定24小時(shí)，自動(dòng)脫水機(jī)中脫水后石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色及紗羅絡(luò)花青髓鞘染色。 3、EAE模型鼠分組及治療 將造模成功的EAE鼠隨機(jī)分為5組，分別為A組：大劑量ICA+MP組；B組：中劑量ICA+MP組；C組：小劑量ICA+MP組；D組：MP組；M組：模型對(duì)照組；N組：正常對(duì)照組。于免疫接種后第13天，小鼠發(fā)病達(dá)高峰時(shí)開始給藥，連續(xù)給藥5天后，于第18天處死、取材。 4、各組免疫相關(guān)因子檢查 各組血清、血漿因子檢測(cè)：眼眶取血，離心后取血清檢測(cè)IL-17、CORT，取血漿檢測(cè)ACTH，嚴(yán)格按照IL-17ELISA試劑盒、CORT、ACTH放免試劑盒進(jìn)行操作檢測(cè)各因子水平。 5、各組腦組織蛋白GR水平檢測(cè) 分別取各組小鼠大腦相同部位→加入含PMSF的組織裂解液研磨→離心取上清液→用BCA法測(cè)蛋白濃度→配平→取各組約40ug蛋白→上樣→電泳→轉(zhuǎn)膜→漂洗→封閉→孵一抗、二抗→顯影。 6、各組流式檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡 腹腔麻醉小鼠后，用剪取0.5cm長(zhǎng)脊髓，以腰膨大處最佳，用PBS及無(wú)菌鑷及眼科剪將脊髓組織研碎，取渾濁液常溫離心兩次，棄上清，留白色沉淀，加入50-100ul冰PBS混懸細(xì)胞，于顯微鏡中觀察，估計(jì)數(shù)目為10000以上，于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)脊髓組織細(xì)胞的凋亡情況，整個(gè)操作均于無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。 研究結(jié)果 小鼠于免疫第8天開始發(fā)病，于免疫第13天，即發(fā)病高峰期給予不同劑量ICA及MP治療后，臨床表現(xiàn)、脊髓組織病理改變及細(xì)胞凋亡情況、外周血炎癥因子水平、腦組織受體蛋白水平等結(jié)果如下： ①體重及臨床評(píng)分變化情況：A組EAE鼠經(jīng)治療后體重較治療前有明顯增加（P=0.0166,P＜0.05），臨床評(píng)分較療前下降（P=0.0258,P＜0.05）。其他組小鼠體重評(píng)分與治療前相比較，雖有所改善，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ②EAE鼠的血清炎癥因子IL-17明顯下降，A、B、C、D組分別與M組相比，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且給予治療后A、B、C、D組炎癥因子水平較N組都減低， P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中以A組炎癥因子水平下降最為明顯，與C、D組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清CORT含量變化顯示：其中A組血清CORT含量較M組明顯下降（P＜0.0001），但與N組無(wú)明顯差異；C、D組血清CORT水平較M組也有明顯下降（P=0.0007，P=0.0053），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于N組；但B組血清CORT水平較N組卻有明顯升高（P＜0.0001），但與M組相比無(wú)明顯差異；血漿ACTH含量變化情況： A、C組較M、N組無(wú)明顯差異；B組較M、N組雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組較M、N組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 ③EAE鼠腦組織有關(guān)受體蛋白表達(dá)影響的變化：A、B、C、D組GR蛋白表達(dá)與M組比較均有增加（P＜0.01），但與N組相比，A、C組較N組均明顯升高（P＜0.0001）；D組與N組比較卻有降低（P=0.0078）；B組與N組無(wú)明顯差異。 ④脊髓組織細(xì)胞凋亡情況：與M組相比，A、B、C、D組細(xì)胞凋亡率均明顯減低，但仍較N組高；各組間以A組凋亡率下降最為明顯，與B、C、D組均有明顯差異（P值分別為0.0025,0.0019,0.0004）。結(jié)論 ICA通過擬雌激素效應(yīng)與MP聯(lián)合應(yīng)用于EAE可協(xié)同降低血清IL-17水平，，血清CORT水平及脊髓組織細(xì)胞的凋亡，并能通過增加腦組織GR的表達(dá)促進(jìn)脊髓再髓鞘化，且均與ICA呈劑量依賴性，以大劑量的ICA與MP聯(lián)用治療效果最為顯著。
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【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R744.51

【參考文獻(xiàn)】

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1 周筠;張秀珍;宋利格;;MAPK信號(hào)通路參與17β-雌二醇對(duì)維生素D受體表達(dá)的調(diào)控[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年12期

本文編號(hào)：1934339