本文選題：CD8~+CD28~+T淋巴細胞 + Ca~(2+)濃度監(jiān)測��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 大器官移植是一個國家器官移植水平的綜合體現(xiàn),而心臟移植是醫(yī)學領(lǐng)域研究多項高精技術(shù)協(xié)作的結(jié)晶,也是衡量一個國家整體器官移植水平的重要依據(jù)之一。有人預測,到二十一世紀中葉,外科手術(shù)的一半都將是器官置換。世界上已有10多萬人接受了心臟移植,而且這個數(shù)字還在以每年5000多例的速度增加。 隨著科學技術(shù)、手術(shù)技術(shù)和圍手術(shù)期管理的技術(shù)不斷提高,心臟移植術(shù)后成功的最大阻礙之一是術(shù)后急性排斥反應。臟器移植術(shù)后不同個體供、受體之間組織相容性存在的差異,產(chǎn)生的排斥反應也不相同。最理想的免疫抑制劑應用策略應該是臟器移植術(shù)后根據(jù)不同個體的排斥反應程度進行“個體化差異”免疫抑制劑應用,即以較小劑量的免疫抑制劑達到滿意的抗排斥反應效果,以減輕藥物的毒副作用,減輕經(jīng)濟負擔。目前尚無簡捷、無創(chuàng)、高效、實時的方法對排斥反應進行監(jiān)測,因此免疫抑制劑很難做到“個體化”應用,以達到高效、低毒副作用的理想狀態(tài)。急性排斥反應仍然是器官移植成功的最大障礙之一。因此,減少臟器移植術(shù)后患者的有創(chuàng)檢查之痛苦,降低用藥費用,減少藥物的毒副作用,提高患者生存質(zhì)量是我們無法回避的重大課題。 探明移植排斥反應的分子機制,尋找高效、快捷、特異、敏感的排斥反應的監(jiān)測方法,具有重大而深遠意義。同種移植物排斥反應是由活化T細胞介導的細胞免疫反應,而細胞內(nèi)鈣及相關(guān)信息傳遞在T細胞激活、增殖和分化中起關(guān)鍵作用。探討T淋巴細胞活化期間細胞內(nèi)鈣及其相關(guān)信息傳遞的內(nèi)在聯(lián)系,以及它們和心臟移植排斥的相關(guān)性,以進一步明確急性排斥反應的分子機制,探明分子水平監(jiān)測急性排斥反應監(jiān)測的新方法,為同種移植排斥反應的監(jiān)測與防治尋找新的突破口。 研究目的 1.采用改良Ono氏腹腔異位心臟移植經(jīng)典模型,總結(jié)手術(shù)心得,進一步探索心臟移植的理想模型,使之用于急、慢性排斥反應機理、免疫耐受、免疫排斥反應監(jiān)測、抗心臟移植排斥反應藥物篩選等臨床和基礎(chǔ)實驗的研究更加方便。 2.本項目從CD8+CD28+T淋巴細胞生物學特性及信號轉(zhuǎn)導方向來研究免疫排斥反應的發(fā)病機理以及T細胞活化期間細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化、細胞外放射性鈣離子(45Ca2+)的攝取與心臟移植急性排斥反應(AR)的相互關(guān)系,可能會是器官移植研究新的突破口。 3.從分子水平研究心臟移植術(shù)后急性排斥反應,有可能發(fā)現(xiàn)更多、更好、更有臨床價值的治療急性排斥反應的新藥物；并能從細胞分子水平探明急性排斥反應的機制,為臨床尋找急性排斥反應的早期診斷找到更簡便有效的方法。 研究方法 1.大鼠腹腔異位心臟移植模型制作 采用改良的Ono氏經(jīng)典大鼠腹腔異位心臟移植模型法,先做預實驗40組,再做正式實驗80組。實驗內(nèi)容主要包括：供、受體麻醉→供、受體準備→供心摘取→受體心臟移植→術(shù)后觀察等步驟。 2.心臟移植急性排斥反應與CD8+CD28+T鈣離子濃度變化的相關(guān)性研究 2.1實驗分組：T1組(正常大鼠組)：SD大鼠(n=24),術(shù)后1、3、5、7天每次隨機抽取6只,6只為一組,共4組；T2組(假手術(shù)組)：SD大鼠(除不行心臟移植外,其他操過程都相同)動物模型(n=24),術(shù)后1、3、5、7天每次隨機抽取6只,6只為一組,共4組；T3組(手術(shù)組)：同種心臟移植組,(WISTAR→SD大鼠)動物模型(n=24),術(shù)后1、3、5、7天每次隨機抽取6只,6只為一組,共4組。 2.2T1組、T2組和T3組分別分成術(shù)后1、3、5、7天4組,每組6只。各組大鼠進行腹主動脈取血,并處死大鼠,移植心臟做病理切片,按照AR分級標準(Stanford標準),進行分級。標本進行編號后行流式細胞儀分析等測定。 2.3比較T1組、T2組和T3組研究移植前后大鼠CD8+CD28+T細胞內(nèi)鈣離子濃度變化規(guī)律以及這些變化與急性排斥反應是否有確定的量效關(guān)系。 2.4統(tǒng)計學方法：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(X±SD)表示,應用spss13.0統(tǒng)計軟件對對照組、假手術(shù)組及模型組進行方差分析,如方差齊性,行方差分析,方差不齊,則行非參數(shù)檢驗。心臟移植組CD8+CD28+T淋巴細胞鈣離子含量與AR進行非參數(shù)Spearman秩相關(guān)分析。P0.05差異具有統(tǒng)計學意義。 3.心臟移植急性排斥反應與CD8+CD28+T胞外45Ca2+攝取率的相關(guān)性研究 3.1實驗分組：T1組(正常SD大鼠組)24只,術(shù)后1、3、5、7天每次隨機抽取6只為1組,共4組；T2組(同種心臟移植組,VISTAR→SD大鼠)24只,造模成功后,術(shù)后1、3、5、7天每次隨機抽取6只,6只為1組,共4組。 3.2CD8+CD28+T細胞獲�。簾o菌條件下?lián)v脾后,通過免疫磁珠分正負兩步分選獲取CD8+CD28+T細胞。 3.3測定CD8+CD28+T細胞外45Ca2+攝取率：用玻璃纖維濾紙收集CD8+CD28+T細胞,干燥后用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。 3.4統(tǒng)計學方法：實驗組與對照組采用Mann-Whitney U test檢驗,實驗組CD8+CD28+T細胞外鈣攝取率與AR的分級進行秩相關(guān)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(X±SD)表示,使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。P0.05差異具有統(tǒng)計學意義。圖1.本項目實驗方案流程簡圖Figure1. The project program flow diagram 研究結(jié)果 1.大鼠腹腔異位心臟移植預實驗40例,存活21例,成功率52.5%。主要死亡原因是術(shù)中創(chuàng)傷大,分離血管操作粗暴至大血管破裂致大鼠休克不能存活,供心摘取時間長、吻合血管時間長心臟不能復跳,大鼠休克不能存活。預實驗完成后,總結(jié)經(jīng)驗教訓,加強圍手術(shù)期的處理,再進行正式實驗,手術(shù)并發(fā)癥明顯減少。正式實驗80例存活70例,存活率87.5%。與預實驗組對比,正式實驗組冷、熱缺血時間、心臟復跳時間、腹主動脈阻斷時間顯著降低,手術(shù)成功率顯著上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.移植心臟病理切片分級(詳見下圖,HE×400)。AR的分級參照Stanford標準進行AR的分級。0級：無排斥,心肌組織正常,無心肌間質(zhì)單核細胞浸潤。1級：有局灶性血管外、心肌間質(zhì)單核細胞浸潤,不伴心肌細胞損害。2級：單灶性單核細胞浸潤,小灶狀心肌細胞損害。3級：彌漫性單核細胞浸潤合并損壞或心肌壞死。4級：彌漫性多類型細胞浸潤,明顯心肌間質(zhì)水腫、出血和心肌壞死。由南方醫(yī)科大學病理學教研室完成。Stanford0級Stanford1級Stanford2級Stanford3級Stanford4級 3.假手術(shù)組在術(shù)后第5天發(fā)現(xiàn)少量炎性細胞浸潤,未發(fā)現(xiàn)心肌水腫、壞死等急性排斥反應的表現(xiàn)。模型組在術(shù)后第1天只發(fā)現(xiàn)局灶性炎細胞浸潤及小灶狀心肌細胞壞死,第3天排斥反應最重,可見彌漫性多類型細胞浸潤,明顯心肌間質(zhì)水腫、出血和心肌壞死,第5天次之,但仍可見炎性細胞浸潤、心肌細胞壞死,第7天減輕。模型組內(nèi)各時間段組CD8+CD28+T細胞內(nèi)鈣離子濃度較假手術(shù)組、對照組顯著增高(P0.01),假手術(shù)組與對照組CD8+CD28+T細胞內(nèi)鈣離子濃度差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。說明術(shù)后CD8+CD28+T淋巴細胞內(nèi)鈣離子濃度與術(shù)后心臟移植發(fā)生急性排斥反應有關(guān),與手術(shù)創(chuàng)傷無關(guān).Spearman相關(guān)分析表明CD8+CD28+T細胞內(nèi)鈣離子濃度與AR的嚴重程度成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.358,相關(guān)顯著(P0.05)。 4.術(shù)后第3、5天實驗組的鈣攝取率[CR:T Mφ(+)/T Mφ(-)]比對照組高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第1、7天差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Spearman相關(guān)分析表明CD8+CD28+T細胞外鈣攝取率與AR的嚴重程度成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.436,相關(guān)顯著(P0.05) 研究結(jié)論 1.通過預實驗建立大鼠心臟移植模型,總結(jié)手術(shù)心得,結(jié)果顯示正式實驗較預實驗冷、熱缺血時間、心臟復跳時間、腹主動脈阻斷時間明顯縮短,手術(shù)成功率顯著提高。Ono大鼠腹腔異位心臟移植方法是心臟移植的基本模型,心臟移植的理想模型以手術(shù)方法簡單、供心缺血時間短、術(shù)后模型穩(wěn)定利于長期實驗觀察為標準。盡管,經(jīng)過很多代醫(yī)學前輩的的不斷實踐與努力,大鼠異位心臟移植模型較之前已取得了很大的改進和創(chuàng)新,但是在動物模型的很多操作技巧上仍有不少值得商榷的地方,需要我們繼續(xù)努力。 2.Ca2+在人體內(nèi)不但具有重要的生理功能,在組織或細胞產(chǎn)生病理反應時其濃度還能反映機體或細胞的病變程度,Ca2+作為細胞內(nèi)的重要信息傳遞物質(zhì),具有調(diào)節(jié)細胞功能、參與信號跨膜傳遞以及介導細胞對外界刺激的應答反應等重要作用。 3.同種移植物排斥反應是T淋巴細胞介導的細胞免疫反應,即通過相應抗原所激活的T細胞聚集于移植物并釋放細胞活性因子產(chǎn)生的免疫損害。T淋巴細胞具有多種調(diào)節(jié)功能,即輔助功能、移植功能和效應功能,這些功能的正常發(fā)揮有賴于T細胞從靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。在同種移植急性排斥反應過程中,激活狀態(tài)的T淋巴細胞介導的細胞學免疫反應是引起免疫排斥反應并導致移植物功能損害的關(guān)鍵。 4.本研究發(fā)現(xiàn)心臟移植大鼠急性排斥反應嚴重程度與CD8+CD28+T細胞表達增高成正相關(guān)。CD8+CD28+T淋巴細胞內(nèi)的鈣離子濃度顯著增加與心臟移植后急性排斥反應發(fā)生及加重有緊密的關(guān)系,且隨急性排斥反應的加重而增高。進一步深入研究外周血CD8+CD28+T淋巴細胞內(nèi)的鈣離子濃度,有助于對急性排斥反應做出診斷。 5.本研究發(fā)現(xiàn)心臟移植大鼠急性排斥反應嚴重程度與胞外鈣離子攝取成正相關(guān)性,CD8+CD28+T細胞外鈣攝取率可以通過液體閃爍計數(shù)儀精確測定,所以這種方法有望成為臨床上一種診斷急性排斥反應簡便,有效的方法。
[Abstract]:Background of the study

Large organ transplantation is a comprehensive reflection of organ transplant levels in a country , and heart transplantation is one of the important bases for the research of high - precision and technical cooperation in the medical field , and it is also an important basis for measuring the overall organ transplantation level of a country . It has been predicted that half of the surgery will be organ replacement in the middle of the twenty - first century . More than 100,000 people in the world have received heart transplantation , and the number is increasing at a rate of more than 5000 per year .

As the technique of science and technology , surgical technique and perioperative management has been continuously improved , one of the greatest obstacles to success after heart transplantation is the acute rejection after operation .

To explore the molecular mechanism of graft rejection , to search for efficient , fast , specific and sensitive methods of rejection , it has important and far - reaching significance . The rejection of allograft is a key role in the activation , proliferation and differentiation of T cells .

Purpose of study

1 . The modified Ono ' s abdominal ectopic heart transplantation classic model is used to summarize the surgical experience and further explore the ideal model of heart transplantation , which makes it more convenient for clinical and basic experiments such as acute and chronic rejection reaction mechanism , immune tolerance , immune rejection reaction monitoring , anti - cardiac graft rejection reaction drug screening and the like .

2 . The relationship between the uptake of extracellular radioactive calcium ions ( 45Ca2 + ) and the acute rejection ( AR ) of heart transplantation could be a new breakthrough in organ transplantation .

3 . To study the acute rejection after heart transplantation from molecular level , and it is possible to find more , better and clinically valuable new drugs for acute rejection .
and the mechanism of acute rejection reaction can be explored from the level of cell molecules , and a more convenient and effective method is found for early diagnosis of clinical finding of acute rejection reaction .

Research Methods

1 . Model of rat abdominal ectopic heart transplantation

In the modified Ono ' s classic rat model of abdominal ectopic heart transplantation , 40 groups were pre - tested and 80 groups were tested . The experimental contents were as follows : donor , receptor anesthesia 鈫，

本文編號：1933175