本文選題：心肌梗死 + 血管生成　； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 心肌梗死是世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原因之一。全世界約三分之一的心衰患者是由它導(dǎo)致的,盡管現(xiàn)在已經(jīng)有了很多治療措施。實(shí)際上,一支主要的冠狀動(dòng)脈的堵塞可以致使心肌的嚴(yán)重缺血和心肌細(xì)胞的快速凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性的纖維化代替心肌組織和左心室的擴(kuò)張。進(jìn)展性的左心室重構(gòu)可以導(dǎo)致心肌梗死后心衰,而心衰患者的預(yù)后目前情況依然不容樂(lè)觀。因此,目前以促進(jìn)新生血管來(lái)增加缺血組織灌注的方法,成為治療缺血性心臟疾病的新的希望。 通心絡(luò)是一種中國(guó)傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑,早在1996年被中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)用于心絞痛和缺血性腦卒中的治療。越來(lái)越多的證據(jù)表明,傳統(tǒng)中藥通心絡(luò)具有心臟保護(hù)作用。通心絡(luò)對(duì)于降低血清脂質(zhì)含量、抑制斑塊炎癥和增強(qiáng)易損斑塊的穩(wěn)定性方面,具有良好的療效。它還可以用來(lái)治療心肌缺血無(wú)復(fù)流和缺血再灌注損傷,并可以改善血管內(nèi)皮功能,然而,我們并不清楚通心絡(luò)在心肌梗死后對(duì)心臟功能和心臟重構(gòu)方面是否有作用。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究通心絡(luò)對(duì)心肌梗死后小鼠的心臟功能和心臟重構(gòu)情況的影響,及其作用機(jī)制。 研究目的： 1.建立小鼠心肌梗死模型,觀察通心絡(luò)對(duì)心肌梗死導(dǎo)致缺血后心臟功能和心室重構(gòu)的影響。 2.闡明通心絡(luò)對(duì)心肌梗死保護(hù)效果的可能的作用機(jī)制。 研究方法： 1.動(dòng)物分組 C57BL/6背景小鼠(10周齡,雄性),隨機(jī)分為5組。(1)假手術(shù)組；(2)心肌梗死模型組,只用生理鹽水溶液灌胃(10mL/kg/day);(3)通心絡(luò)低劑量治療組,通心絡(luò)灌胃量為0.38克/千克體重/天；(4)通心絡(luò)中劑量治療組,通心絡(luò)灌胃量為0.75克/千克體重/天；(5)通心絡(luò)高劑量治療組,通心絡(luò)灌胃量為1.5克/千克體重/天。術(shù)前預(yù)喂藥1周,術(shù)后持續(xù)灌胃30天,分別在術(shù)后第7天處死各組實(shí)驗(yàn)小鼠10只～15只,30天末處死剩余全部小鼠。 2.小鼠心肌梗死模型的建立 使用異氟烷麻醉小鼠并給予維持,建立呼吸支持,模型組與治療組均行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)。頸部及左前胸脫毛,剪開(kāi)頸部皮膚,行氣管插管。建立有效呼吸支持后,開(kāi)胸,剪開(kāi)心包,暴露冠狀動(dòng)脈左前降支。用7-0的無(wú)損縫合線進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎,結(jié)扎成功后,左心室前壁會(huì)變蒼白并且運(yùn)動(dòng)異常,逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只開(kāi)胸穿線,不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,手術(shù)時(shí)間與其他組匹配。 3.超聲分析 術(shù)后30天時(shí),將異氟烷麻醉的小鼠進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè),用來(lái)評(píng)估左心室功能。選取頻率為35MHz的712型超聲探頭進(jìn)行的心臟大小和功能參數(shù)的采集,用高分辨率超聲Vevo770系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。探頭放置于小鼠左前胸,在心臟乳頭肌水平進(jìn)行M型超聲檢測(cè),測(cè)量舒張末期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDs)。系統(tǒng)自動(dòng)算出射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率。 4.組織學(xué)分析 術(shù)后7天、30天,處死相應(yīng)小鼠,使用小鼠左心室石蠟切片進(jìn)行組織學(xué)分析。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后,開(kāi)胸,剪開(kāi)右心耳,進(jìn)行生理鹽水灌注,注射少量10%氯化鉀使之停搏在舒張期,待血液沖洗干凈,進(jìn)行甲醛灌注固定、組織脫水、浸蠟切片。制備5μm石蠟于HE染色、Masson三色染色及免疫組化(熒光)染色。使用HE染色切片計(jì)算左心室梗死百分比；使用Masson染色進(jìn)行測(cè)量梗死周邊區(qū)間質(zhì)纖維化；使用免疫組化檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的陽(yáng)性率。分析使用IPP圖像處理軟件。 5.凋亡檢測(cè) 使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡率,整個(gè)核完全被染色的心肌細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。 6.毛細(xì)血管密度 使用CD31(PECAM-1)作為血管內(nèi)皮標(biāo)志物,檢測(cè)圍梗死區(qū)毛細(xì)血管密度。 7.蛋白表達(dá)水平檢測(cè)(Western Blot) 術(shù)后7天,提取梗死心臟周邊區(qū)的組織進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。提取蛋白、測(cè)定蛋白濃度、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗及二抗最后用化學(xué)發(fā)光顯色。用IPP軟件進(jìn)行表達(dá)量分析。 8.凝膠電泳遷移分析(EMSA) 使用凝膠電泳遷移分析(EMSA)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1a活性。提取圍梗死區(qū)心臟組織核蛋白,電泳,交聯(lián),封閉,化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。 9.數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS18.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析。組間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析方法,檢驗(yàn)方差齊性,若數(shù)據(jù)方差齊,使用LSD檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)方差不齊,使用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果 1.一般情況及生存率分析 假手術(shù)組小鼠術(shù)后無(wú)死亡,一般情況良好。通心絡(luò)干預(yù)減少了實(shí)驗(yàn)性心肌梗死小鼠的死亡率。 2.心臟超聲檢測(cè) 術(shù)后30天檢測(cè)左心室功能參數(shù),通心絡(luò)治療改善了心肌梗死后心臟功能參數(shù)。 3.梗死大小 HE染色顯示,應(yīng)用通心絡(luò)治療后,梗死百分比顯著減小。 4.心肌間質(zhì)纖維化 使用Masson染色檢測(cè)梗死周邊區(qū)的纖維化程度。應(yīng)用通心絡(luò)后,可以顯著減少心梗引起的纖維化情況。 5. TUNEL染色 經(jīng)過(guò)通心絡(luò)干預(yù)后,心肌梗死引發(fā)的凋亡情況顯著改善。 6.毛細(xì)血管密度 與模型組相比較,通心絡(luò)各組表現(xiàn)出更高的毛細(xì)血管密度。 7. Western blot 通心絡(luò)治療可以增加P13K、磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化eNOS和血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)。 8. EMSA 通心絡(luò)治療增加了缺氧誘導(dǎo)因子1α的DNA結(jié)合活性。 結(jié)論： 1.通心絡(luò)具有改善心肌梗死小鼠后心臟功能和減弱心室重構(gòu)的作用。 2.通心絡(luò)可以增加心肌梗死周邊區(qū)的微血管密度、減小心室梗死百分比、減輕心肌間質(zhì)纖維化程度。 3.通心絡(luò)可以激活血管生成通路的重要因子PI3K/AKT、ERK、HIF-1α、VEGF及p-eNOS,說(shuō)明通心絡(luò)的心臟保護(hù)作用可能是通過(guò)激活血管生成信號(hào)通路而完成的。 研究背景： 心肌梗死(MI)是冠狀動(dòng)脈閉塞,流向心臟的血流受阻的一種典型的缺血性心臟病。2013年世界衛(wèi)生組織的世界衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告表明,缺血性心臟疾病呈上升趨勢(shì),仍然是全球死亡的最常見(jiàn)原因,構(gòu)成約所有死亡人數(shù)的14%。心肌梗死的情況下血管生成受損,受損的血管生成可以導(dǎo)致血管閉塞的血流恢復(fù)不完全,并且導(dǎo)致組織缺血,心肌缺血引起心肌細(xì)胞的死亡,惡性的心室重構(gòu)和心室功能不全,其嚴(yán)重程度是決定預(yù)后情況的重要因素。 組織的新生血管是對(duì)血管閉塞性疾病的非常重要的適應(yīng)性反應(yīng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,后天的組織血管生成不僅依靠從原來(lái)存在的內(nèi)皮中“出芽”式生長(zhǎng),骨髓來(lái)源的循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)對(duì)血管生成的作用也非常的重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞可以歸巢到缺血組織中,促進(jìn)血管生成。心肌梗死后,數(shù)量不足的內(nèi)皮祖細(xì)胞不足以完成足夠的血管生成,進(jìn)而使得心肌梗死的情況更加惡化。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)表明,增強(qiáng)EPCs的動(dòng)員,使用EPCs治療急性心肌梗死可以減少心肌梗死大小,改善心臟功能。 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α/趨化因子受體4(SDF-1a/CXCR4)系統(tǒng)在心肌梗死后,祖細(xì)胞/動(dòng)員和招募過(guò)程中,起到了非常重要的作用。在骨髓來(lái)源的干細(xì)胞,包括內(nèi)皮祖細(xì)胞,都表達(dá)CXCR4,可以趨化運(yùn)動(dòng)到心臟組織中,促進(jìn)心肌梗死后的血管生成。 在我們第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們已經(jīng)證明了通心絡(luò)治療可以改善心肌梗死后的心臟功能,增加其血管生成。但是,在心肌梗死的情況下,通心絡(luò)對(duì)EPCs的影響仍不清楚。為此,提出本實(shí)驗(yàn)的假說(shuō),通心絡(luò)可以通過(guò)激活SDF-1α/CXCR4系統(tǒng),調(diào)節(jié)心肌梗死后EPCs的動(dòng)員,改善EPCs的成管功能,改善心肌梗死。 研究目的： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察通心絡(luò)對(duì)心肌梗死后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員情況； 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察通心絡(luò)對(duì)SDF-la在缺血心臟中的表達(dá)情況； 3.體外實(shí)驗(yàn)觀察通心絡(luò)對(duì)骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的成管功能的影響； 4.探索通心絡(luò)增強(qiáng)骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的成管功能的機(jī)制。 研究方法： 1.動(dòng)物分組： 雄性10周齡～12周齡,C57BL/6背景小鼠,隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、心肌梗死模型組、通心絡(luò)低劑量組、通心絡(luò)中劑量組、通心絡(luò)高劑量組。 2.建立心肌梗死模型： 異氟烷維持麻醉小鼠,建立呼吸支持,模型組與治療組均行進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)。頸部及左前胸脫毛,剪開(kāi)頸部皮膚,行氣管插管。建立有效呼吸支持后,開(kāi)胸,剪開(kāi)心包,暴露冠狀動(dòng)脈左前降支。用7-0的無(wú)損縫合線進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎,結(jié)扎成功后,左心室前壁會(huì)變蒼白并且運(yùn)動(dòng)異常,逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只開(kāi)胸穿線,不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,手術(shù)時(shí)間與其他組匹配。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血EPCs的含量 取心肌梗死后3天的小鼠外周血。分離外周血單核細(xì)胞,室溫下孵育FITC標(biāo)記的CD34抗體和APC標(biāo)記的KDR抗體90分鐘。然后PBS沖洗兩次。上機(jī)待檢。雙陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是EPCs。 4.EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定 無(wú)菌條件下,使用EGM-2將小鼠下肢骨骨髓腔內(nèi)的骨髓沖出,繼而使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,離心,重懸。使用EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)為原代EPCs。將誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的細(xì)胞,使用DiL-acLDL攝入實(shí)驗(yàn)染色與FITC-UEA-1-lectin染料熒光雙染,將兩者皆為陽(yáng)性的細(xì)胞,鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞。 5.MTT檢測(cè) 使用濃度為0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、2000μg/mL的通心絡(luò)刺激培養(yǎng)7天的EPCs,48小時(shí)后收集EPCs檢測(cè)其細(xì)胞活力。 6.最佳作用濃度的篩選 使用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)后,分別以含通心絡(luò)0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的終濃度的EGM-2加入含有EPCs的培養(yǎng)孔中,24小時(shí)后收集提取各孔細(xì)胞,待后續(xù)檢測(cè)CXCR4的表達(dá)量。 7.最佳作用時(shí)間的篩選 使用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)后,以含200μg/mL通心絡(luò)的EGM-2分別作用EPCs Oh.6h.12h.18h.24h.36h提取各孔細(xì)胞,待后續(xù)CXCR4表達(dá)量的檢測(cè)。 8.體外成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 分為對(duì)照組、通心絡(luò)組,通心絡(luò)+AMD3100組。將BD基質(zhì)膠在4℃條件下過(guò)夜融化,第二天鋪板,預(yù)冷的吸頭吸取50μL基質(zhì)膠到96孔板中,37℃孵箱中孵育30分鐘,待其成膠。將經(jīng)歷不同的刺激之后的各組EPCs,取50μL含104EPCs的EGM-2鋪到膠上。8小時(shí)后,觀察計(jì)算管腔形成程度。 9.免疫組化分析 取術(shù)后3天小鼠左心室組織,4%的多聚甲醛固定24小時(shí),石蠟包埋,制備5μm切片行免疫組化分析。脫蠟、抗原修復(fù)、H202清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉、4℃過(guò)夜孵育SDF-1a抗體、37℃孵育二抗30分鐘、DAB顯色、蘇木素染核。 10. RT-PCR 提取術(shù)后3天梗死心臟周邊區(qū)的組織及相應(yīng)刺激后的EPCs細(xì)胞RNA、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR檢測(cè)CXCR4和GAPDH轉(zhuǎn)錄水平。目的基因的相對(duì)表達(dá)量使用2-△△ct的計(jì)算方法。 11.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 數(shù)據(jù)使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示,應(yīng)用SPSS18.0,采用單因素方差分析(One Way ANOVA)比較組間數(shù)據(jù)。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.通心絡(luò)上調(diào)了外周血中的EPCs的含量 假手術(shù)組的外周血EPCs含量較少,心肌梗死模型組中的EPCs含量顯著增多,與模型組相比較,通心絡(luò)組進(jìn)一步上調(diào)了外周血EPCs含量。 2.免疫組化結(jié)果 通心絡(luò)增加了心臟SDF-la的表達(dá)。與假手術(shù)組相比較,模型組SDF-la表達(dá)有所增加。通心絡(luò)干預(yù)增加了心肌組織的SDF-la表達(dá)量。 3.骨髓來(lái)源EPCs培養(yǎng)、鑒定結(jié)果 我們展示了從骨髓中提取EPCs的培養(yǎng)情況。使用Dil-ac LDL及FITC-UEA-1lectin雙染陽(yáng)性的結(jié)果顯示,培養(yǎng)的是我們實(shí)驗(yàn)所需要的細(xì)胞。 4.通心絡(luò)對(duì)EPCs細(xì)胞活性的影響 50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的通心絡(luò)均可促進(jìn)EPCs細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞活性,然而發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)濃度為800μg/mL與1000μg/mL作用的EPCs,細(xì)胞活力顯著減低,提示我們以下的實(shí)驗(yàn)采用400μg/mL以內(nèi)的刺激濃度。 5.通心絡(luò)作用內(nèi)皮祖細(xì)胞的最佳濃度及作用時(shí)間 我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含通心絡(luò)濃度為200μg/mL的EGM-2培養(yǎng)液刺激EPCs24小時(shí),CXCR4表達(dá)即到達(dá)最高值。 6. EPCs細(xì)胞成管功能檢測(cè) 與空白組相比較,通心絡(luò)組成管能力顯著增高,而加入AMD3100后,這種改善被廢除。 結(jié)論： 1.在體實(shí)驗(yàn)：通心絡(luò)可以增強(qiáng)心肌梗死后外周血EPCs的動(dòng)員； 2.在體實(shí)驗(yàn)；通心絡(luò)上調(diào)心肌梗死后,心肌組織的SDF-la和CXCR4表達(dá)水平； 3.200μg/mL通心絡(luò)刺激EPCs24小時(shí),CXCR4表達(dá)量最高,此時(shí)EPCs的成管功能明顯增強(qiáng),AMD3100可以廢除這種作用。 4.通心絡(luò)通過(guò)上調(diào)EPCs CXCR4表達(dá),激活SDF-1a/CXCR4增強(qiáng)其細(xì)胞功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R259;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1828338