發(fā)布時(shí)間：2018-04-30 10:39

  本文選題：地塞米松 + 膝骨性關(guān)節(jié)炎��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：1.研究背景：膝骨性關(guān)節(jié)炎是很常見的骨科疾病,隨著老齡社會(huì)的到來,其發(fā)病率以驚人的速度逐年增長,據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)資料顯示,在50歲以上人口中,膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率僅次于心臟病而居第二位。膝骨性關(guān)節(jié)炎的從病理學(xué)角度上來說是膝關(guān)節(jié)軟骨組織破壞和修復(fù)相互交替的復(fù)雜過程,同時(shí)伴有關(guān)節(jié)和滑膜組織的繼發(fā)性炎癥。根據(jù)這一本質(zhì),膝骨性關(guān)節(jié)炎是許多種因素和過程相互作用及影響造成的最終結(jié)果,其發(fā)生和發(fā)展最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是軟骨的損傷和破壞。膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程中,既有關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)和功能的修復(fù),又有關(guān)節(jié)軟骨的退行性變,這一病理過程受到多種復(fù)雜因素的調(diào)控,年齡被公認(rèn)為是最主要的危險(xiǎn)因素。在老年人群中,不但膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率隨年齡增加而升高,而且膝關(guān)節(jié)軟骨組織退變的程度和疼痛等癥狀也不斷加重,其主要原因是隨年齡的增長人體各項(xiàng)生理功能而逐漸下降,機(jī)體器官組織的衰老,關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)能力和關(guān)節(jié)組織保護(hù)結(jié)構(gòu)的功能均下降,其他危險(xiǎn)因素如果在此時(shí)誘發(fā),就極易發(fā)展為膝骨性關(guān)節(jié)炎。衰老是指缺陷和受損的細(xì)胞成分進(jìn)行性聚集,最終導(dǎo)致器官老化和機(jī)體組織生理功能下降的過程。在組織水平,生物大分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))和細(xì)胞器的損傷以及毒性修飾的聚集是衰老的一個(gè)非常明顯的特點(diǎn)。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)在衰老過程中內(nèi)環(huán)境維持系統(tǒng)收到損害,現(xiàn)在越來越多的研究開始關(guān)注自噬系統(tǒng)的衰老相關(guān)性改變。自噬與細(xì)胞凋亡和增殖發(fā)生過程及穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān),是生命進(jìn)化過程中具有高度保守性的細(xì)胞行為之一,其主要參與細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)循環(huán)和再利用、受損細(xì)胞器清除降解,在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的自我穩(wěn)態(tài)及促進(jìn)細(xì)胞生存方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞器受損時(shí),為了抑制細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng),通過明顯升高其自噬水平從而清除受損細(xì)胞器,從而起到保護(hù)細(xì)胞和組織的作用。在軟骨組織退變過程中,軟骨細(xì)胞的凋亡起著關(guān)鍵作用,因此阻斷軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生和發(fā)展,有可能促進(jìn)退變軟骨修復(fù),從而減緩甚至阻止膝骨性關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程。在抑制軟骨細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)過程中自噬發(fā)揮重要的調(diào)控作用,提示通過各種方法對(duì)自噬進(jìn)行干預(yù)有可能是防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在有效途徑之一。2.研究目的：早期采用關(guān)節(jié)腔注射糖皮質(zhì)激素可以緩解疼痛并取得良好效果,但是,長期反復(fù)注射地塞米松可破壞軟骨細(xì)胞的代謝平衡,并可以引起軟骨細(xì)胞的死亡或凋亡,從而減少軟骨細(xì)胞數(shù)量和導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨組織退變程度進(jìn)一步加重的后果。因此,探索糖皮質(zhì)激素副作用的機(jī)制并尋找應(yīng)對(duì)策略,確保其療效又減少副作用,顯得尤為重要。自噬是否是軟骨細(xì)胞在糖皮質(zhì)激素下適應(yīng)性地升高而對(duì)軟骨產(chǎn)生一個(gè)保護(hù)作用?自噬與衰老在地塞米松作用下的關(guān)系又如何?尚不得而知。3.研究內(nèi)容：3.1體外試驗(yàn)部分SD大鼠原代膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與地塞米松、3-甲基腺嘌呤(3-MA)混合培養(yǎng)地塞米松(DX)濃度：空白組,0.1ug/mL,1ug/mL,25ug/mL,50ug/mL。3-MA與地塞米松混合分為5組：1 mmol/L 3-MA+0.1ug/mL DX,1 mmol/L 3-MA+lug/mL DX,1 mmol/L 3-MA+25ug/mL DX,1 mmol/L 3-MA+50ug/mLDX,1 mmol/L 3-MA。上述各組和軟骨細(xì)胞混合培養(yǎng)后第2天,第4天,第6天分別用LysoTracker Red和MDC染色觀察自噬囊泡的生成情況,Western blot檢測(cè)LC3、beclin-1、P62、p70S6K和4EBP1蛋白表達(dá)的變化。β-半乳糖苷酶染色分析地塞米松對(duì)軟骨細(xì)胞衰老的影響。3.2大鼠成體祖細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)大鼠原代成體祖細(xì)胞及軟骨細(xì)胞并鑒定之。將傳代的軟骨細(xì)胞接種于Transwell 6板下層,對(duì)照組上層放置培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組將第二代MAPC細(xì)胞接種于上層,孔徑為0.3μm的聚碳酸酯膜隔置于中間,。上層于共培養(yǎng)4天后移去,將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液放置于5%胎牛血清培養(yǎng)液中,觀察細(xì)胞形態(tài),第7天終止培養(yǎng),采用抗Ⅱ型膠原抗體熒光標(biāo)記軟骨細(xì)胞。雙盲法分別計(jì)數(shù)兩組在熒光顯微鏡下陽性細(xì)胞比例,取平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。共培養(yǎng)14天后,提取細(xì)胞RNA。RT-PCR方法檢測(cè)Ⅱ型膠原mRNA和聚集蛋白多糖含量。測(cè)定RNA在280 nm和260 nm處的吸光度,計(jì)算RNA濃度和純度。應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,記數(shù)資料均采用(x±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.3單純切除前交叉韌帶建立SD大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型SD大鼠10只,僅單純切除前交叉韌帶,術(shù)后2周、4周、6周脫頸處死。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的SD大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型膝關(guān)節(jié)組織采用HE染色,甲苯胺藍(lán)染色和Masson染色,按照Mankin評(píng)分進(jìn)行分級(jí)評(píng)定。3.4體內(nèi)試驗(yàn)部分建立大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型SD大鼠30只,分為A、B、C三組,每組各10只,A組僅切開皮膚模擬造模手術(shù)6周后在膝關(guān)節(jié)注射地塞米松, B組單純前交叉韌帶切斷造模術(shù)后6周在膝關(guān)節(jié)腔中注射地塞米松,C組單純前交叉韌帶切斷造模術(shù)后6周在膝關(guān)節(jié)腔中注射生理鹽水。每組里面又分2個(gè)小組(即A1、A2, B1、B2, C1、C2); A1、B1和C1組為術(shù)后6周注射一次藥物；A2、B2和C2組為術(shù)后6周注射-次藥物和術(shù)后7周注射一次藥物。隨機(jī)取材行膝關(guān)節(jié)軟骨組織的HE染色、Masson染色、番紅O固綠染色、β-半乳糖苷酶染色和LC3免疫組化染色進(jìn)行衰老和自噬的評(píng)估。4.研究方法：4.1地塞米松對(duì)軟骨細(xì)胞自噬和衰老的影響4.1.1大鼠原代膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：用解剖刀將膝關(guān)節(jié)軟骨組織切成1mm3的小塊,放入培養(yǎng)皿,用PBS淹蓋。收集全部切碎的軟骨組織,去除PBS,加入適量的0.5%透明質(zhì)酸酶,室溫下作用5分鐘。除去透明質(zhì)酸酶,再次加入適量新鮮的0.5%透明質(zhì)酸酶室溫下作用10分鐘。用0.2%胰蛋白酶沖洗軟骨組織碎塊2次,去除用過的胰蛋白酶,加入適量新鮮的0.2%胰蛋白酶,37℃下作用30分鐘。去除胰蛋白酶,用PBS清洗2次。用適量的0.2%膠原酶清洗5分鐘,去除清洗液后再加入適量膠原酶,37℃下作用90分鐘。收集上清液,離心三次,收集細(xì)胞,把細(xì)胞懸浮于適量培養(yǎng)液中(含12%FCS)在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。4.1.2試驗(yàn)分組：地塞米松分為5組：空白組,0.1mg/L,1mg/L,25mg/L,50mg/L。3-MA與地塞米松(DXM)混合分為5組：空白組、10mmol/L3-MA、10mmol/L 3-MA+25mg/L DXM、25mg/L DXM。時(shí)間點(diǎn)：軟骨細(xì)胞與上述各組混合培養(yǎng)后第2天,第4天,第6天。4.1.3 Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞的LC-3,Beclin-1的蛋白表達(dá)提取和測(cè)定總蛋,蛋白制樣及電泳,將蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,濕轉(zhuǎn)法,封閉與顯色4.1.4 LysoTracker Red染色不同濃度的地塞米松作用軟骨細(xì)胞4天后。使用新鮮的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3遍,滴加LysoTracker Red后在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘。使用綠色濾光片在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況。4.1.5 MDC染色經(jīng)處理關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞使用PBS清洗3遍后,使用MDC在37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘。PBS洗滌細(xì)胞3次,使用紫外激發(fā)光直接在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。染色后的細(xì)胞再上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞自噬率的檢測(cè)。4.1.6 β-半乳糖苷酶染色軟骨細(xì)胞和25 mg/L的地塞米松混合培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后使用p-半乳糖苷酶固定液在室溫下固定,再使用p-半乳糖苷酶染液染色12小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。4.1.7 GFP-RFP-LC3測(cè)定在地塞米松激素處理前,當(dāng)軟骨細(xì)胞的融合度達(dá)到50-70%的時(shí)候,轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3腺病毒。感染復(fù)數(shù)適宜值為100。37℃下使用腺病毒孵育軟骨細(xì)胞2小時(shí)。再使用地塞米松處理來排除饑餓對(duì)自噬的影響。使用不同劑量的地塞米松處理4天后,使用共聚焦顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞中的自噬體和自噬溶酶體。4.1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間差異比較采用單因素方差分析,兩兩之間比較用Turkey's方法進(jìn)行檢測(cè),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2大鼠成體祖細(xì)胞(MAPC)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化4.2.1 MAPC原代培養(yǎng)及鑒定抽取SD大鼠骨髓5 ml注入培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)1天后換液,移去未貼壁細(xì)胞,每3天換液1次。細(xì)胞80%～90%融合后PBS洗滌2次,胰酶消化1分鐘,用吸管吹打至單細(xì)胞懸液,離心10分鐘后棄去上清液,接種于培養(yǎng)瓶中。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,錐蟲藍(lán)染色,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),取平均值。將第2代MAPC消化,加入熒光標(biāo)記抗體,用PBS洗去多余抗體,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞陽性率。4.2.2軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定將SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨切成約2 mm3置于無菌試管,PBS沖洗后下離心3分鐘。逐次用胰酶及Ⅱ型膠原酶放置孵箱內(nèi)消化。收集消化液離心3分鐘后棄去上清液,以1×105/ml接種于含有DMEM培養(yǎng)液的營養(yǎng)瓶中。原代細(xì)胞貼壁融合后傳代培養(yǎng),2天換液一次。觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)并甲苯胺藍(lán)染色鑒定。4.2.3 MAPC與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)收集第2代軟骨細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,接種于Transwell 6孔板下層,對(duì)照組上層放置培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組將第二代MAPC細(xì)胞以同樣密度接種于上層,孔徑為0.3μm的聚碳酸酯膜隔置于中間。觀察細(xì)胞形態(tài)變化,兩天換液1次。4.2.4共培養(yǎng)對(duì)MAPC轉(zhuǎn)化軟骨細(xì)胞對(duì)比共培養(yǎng)4天后移去上層,將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞懸液放置于5%胎牛血清培養(yǎng)液中,每2天換液一次,第7天終止培養(yǎng),軟骨細(xì)胞用抗Ⅱ型膠原抗體熒光標(biāo)記。隨機(jī)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各選取10個(gè)視野,用雙盲法分別計(jì)數(shù)兩組在熒光顯微鏡下陽性細(xì)胞比例,取平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4.2.5 RT-PCR檢測(cè)聚集蛋白多糖和Ⅱ型膠原nRNA含量共培養(yǎng)14天后,提取細(xì)胞RNA。RT-PCR方法檢測(cè)聚集蛋白多糖和Ⅱ型膠原mRNA含量。測(cè)定RNA在280 nm和260 nm處的吸光度,計(jì)算RNA濃度和純度。4.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,記數(shù)資料均采用(x±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.3單純切除前交叉韌帶建立SD大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型4.3.1手術(shù)操作用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后,常規(guī)備皮消毒手術(shù)區(qū)域。取膝關(guān)節(jié)髕旁內(nèi)側(cè)切口,切開皮膚及關(guān)節(jié)囊進(jìn)入關(guān)節(jié)腔,向外側(cè)牽拉開髕骨,盡量屈曲膝關(guān)節(jié)以顯露前交叉韌帶,在直視下橫向切斷前交叉韌帶并行前抽屜試驗(yàn)確認(rèn)已完全斷裂。逐層縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。4.3.2術(shù)后處理每天每只大鼠肌肉注射青霉素20萬單位預(yù)防感染持續(xù)3天。大鼠分別于術(shù)后2周、4周、6周脫頸處死。取關(guān)節(jié)軟骨以10%福爾馬林固定后行組織學(xué)切片觀察。4.3.3評(píng)估分期膝關(guān)節(jié)軟骨行HE染色、Masson染色及甲苯胺藍(lán)染色,根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行Mankin評(píng)分。4.4體內(nèi)試驗(yàn)部分4.4.1建立大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切口,切斷前交叉韌帶,注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面,逐層縫合關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后每天每只注射丁胺卡那霉素,連續(xù)3天,籠內(nèi)自由活動(dòng)。術(shù)后6周大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型建立。地塞米松藥液的配置：一支劑量為0.125g(5ml),按照成人體重60kg計(jì)算,人體常規(guī)用量為0.42mg/kg,按照人和大鼠用藥劑量換算公式為：大鼠劑量(mg/kg)=6.25×0.42mg/kg。即每只大鼠(270g)每次注射 0.709mg (0.028ml)即為相應(yīng)人體的常規(guī)劑量。4.4.2實(shí)驗(yàn)分組：SD大鼠30只,分為A、B、C三組,每組各10只,A組僅切開皮膚模擬造模手術(shù)6周后在膝關(guān)節(jié)注射地塞米松, B組單純前交叉韌帶切斷造模術(shù)后6周在膝關(guān)節(jié)腔中注射地塞米松,C組單純前交叉韌帶切斷造模術(shù)后6周在膝關(guān)節(jié)腔中注射生理鹽水。每組里面又分2個(gè)小組(即A1、A2, B1、B2, C1、C2);A1、B1和C1組為術(shù)后6周注射一次藥物；A2、B2和C2組為術(shù)后6周注射第一次藥物和術(shù)后7周注射第二次藥物。隨機(jī)取材行膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行HE染色、Masson染色、番紅。固綠染色、β-半乳糖苷酶染色和LC3免疫組化染色,分別在鏡下觀察HE染色切片,Masson染色切片,番紅O/固綠染色切片,p-半乳糖苷酶染色切片和LC3免疫組化切片并評(píng)估衰老和自噬。5.結(jié)果5.1地塞米松對(duì)軟骨細(xì)胞自噬和衰老的影響對(duì)地塞米松作用4天后軟骨細(xì)胞進(jìn)行Lyso-Tracker染色發(fā)現(xiàn)隨著地塞米松的濃度增加Lyso-Tracker染色陽性細(xì)胞數(shù)量也急劇增加。經(jīng)地塞米松處理的軟骨細(xì)胞MDC染色和流式細(xì)胞儀分析。隨著地塞米松濃度的上升,軟骨細(xì)胞的MDC染色熒光強(qiáng)度明顯增加。經(jīng)地塞米松作用后軟骨細(xì)胞自噬的發(fā)生率與對(duì)照組相比明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)4天后,與對(duì)照組相比,地塞米松明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞胞漿中點(diǎn)狀的紅色熒光和黃色熒光的數(shù)量,融合后形成點(diǎn)狀的黃色自噬體已經(jīng)部分紅色的自噬溶酶體,并且具有劑量依賴性,這提示地塞米松可以明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞中自噬流的形成,使得細(xì)胞中的自噬體逐漸地轉(zhuǎn)化成為自噬溶酶體。當(dāng)軟骨細(xì)胞在不同濃度的地塞米松作用2天后,不同組之間的LC3-Ⅱ/β-actin沒有明顯差異；但是,LC3-Ⅱ/β-actin表達(dá)水平在混合培養(yǎng)4天后隨著地塞米松的濃度增加而顯著升高；6天后,在地塞米松濃度最高水平LC3-Ⅱ/β-actin的表達(dá)稍有下降。在P62、Beclin-1表達(dá)水平的變化與LC3-II的表達(dá)非常相似。p-p70S6K和p-4EBP1的表達(dá)水平在1mg/L和25mg/L地塞米松處理組相對(duì)于對(duì)照組明顯降低,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這表明地塞米松是通過mTOR依賴途徑抑制自噬。隨著地塞米松作用時(shí)間的延長,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的p-半乳糖苷酶染色陽性率明顯升高,作用72小時(shí)后最高。單純3-MA的作用并沒有引起軟骨細(xì)胞的p-半乳糖苷酶染色陽性率增加。但是采用3-MA與地塞米松共同作用軟骨細(xì)胞72小時(shí)后自噬被3-MA抑制,軟骨細(xì)胞中p-半乳糖苷酶染色的陽性率相對(duì)于單純地塞米松組明顯升高。5.2成體祖細(xì)胞(MAPC)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)前者向軟骨細(xì)胞分化在培養(yǎng)后24小時(shí)內(nèi)原代MAPC大多數(shù)貼壁,呈多角形。24小時(shí)內(nèi)換液,以后每2天換液1次,8天內(nèi)貼壁其他細(xì)胞多死亡。剩余MAPC形態(tài)為長條形或梭形,呈克隆樣生長。傳代的MAPC細(xì)胞在1天內(nèi)即出現(xiàn)生長,倍增時(shí)間約為2天。由生長曲線可見,MAPC在接種1天后開始增殖,第2-4天為對(duì)數(shù)生長期,第6天時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1.32×106/ml,然后進(jìn)入平臺(tái)期。SD大鼠軟骨細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)貼壁,呈三角形或四角形,6天內(nèi)貼壁的其他細(xì)胞多死亡。剩余的軟骨細(xì)胞生長旺盛,甲苯胺藍(lán)染色顯示軟骨細(xì)胞存活及傳代較穩(wěn)定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,SSEA-1和CD13陽性細(xì)胞的百分比分別為21.47%和14.31%,說明細(xì)胞中MAPC占大部分。RT-PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組聚集蛋白多糖mRNA含量分別是1.46±0.51、6.61±0.34,Ⅱ型膠原mRNA含量分別是2.14±0.48、8.37±0.79,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.3單純切除前交叉韌帶建立SD大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型術(shù)后2周HE染色見軟骨表面出現(xiàn)少數(shù)散在的不規(guī)則裂隙；甲苯胺藍(lán)染色均勻且呈深藍(lán)；Masson染色軟骨基質(zhì)被染成藍(lán)色,染色較均勻,細(xì)胞排列規(guī)則。術(shù)后4周HE染色見軟骨細(xì)胞輕度增生,細(xì)胞排列開始出現(xiàn)紊亂,軟骨淺層出現(xiàn)裂隙,表層及中層細(xì)胞收縮；甲苯胺藍(lán)染色不均勻；Masson染色軟骨基質(zhì)被染成藍(lán)紅相間色,細(xì)胞分布規(guī)則。術(shù)后6周HE染色見軟骨層變薄,軟骨細(xì)胞排列層次紊亂,表面纖維化明顯,軟骨細(xì)胞數(shù)量有所減少;甲苯胺藍(lán)染色見軟骨組織大部分層次染色明顯變淺；Masson染色見紅色部分面積較多,藍(lán)色部分面積較少。單純切除前交叉韌帶造模術(shù)后2周Mankin評(píng)分是1.6分,術(shù)后4周Mankin評(píng)分是4.8分,術(shù)后6周Mankin評(píng)分是7.2分。5.4地塞米松對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的作用p-半乳糖苷酶染色：A1與B1,C1均有顯著性差異,A2和B2有顯著性差異,B2和C1有顯著性差異；LC3免疫組化：A1與B1有顯著性差異,A2與B2有顯著性差異,B2與C2有顯著性差異。局部注射地塞米松后B1和C1兩組及B2和C2兩組均無明顯差異,并沒有導(dǎo)致軟骨衰老加重；軟骨細(xì)胞自噬則表現(xiàn)出收到地塞米松的誘導(dǎo)作用,所以與前面體外軟骨細(xì)胞部分研究結(jié)果相似,地塞米松誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬同時(shí)抑制了衰老,因此可以解釋有許多患者膝關(guān)節(jié)局部注射封閉后自覺疼痛癥狀緩解。6.結(jié)論6.1地塞米松誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的衰老,并同時(shí)激活軟骨細(xì)胞中的自噬,而自噬在這過程中對(duì)細(xì)胞的衰老可能具有代償性的保護(hù)作用。同時(shí)地塞米松抑制mTOR信號(hào)通路,可能與自噬的激活相關(guān)。6.2成體祖細(xì)胞(MAPC)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后可誘導(dǎo)前者向軟骨細(xì)胞定向分化。6.3單純切除前交叉韌帶法可以造成大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型,而且對(duì)膝關(guān)節(jié)組織損傷小,術(shù)后6周可以觀察到早中期骨關(guān)節(jié)炎病理變化。6.4中期膝骨性關(guān)節(jié)炎患者注射地塞米松后不會(huì)加重軟骨衰老,但自噬會(huì)明顯發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R684.3

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本文編號(hào)：1824232