本文選題：減味壽胎丸 + 蛻膜細胞　； 參考：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的： 以減味壽胎丸總黃酮含量為指標(biāo),通過單因素考察和正交設(shè)計,優(yōu)化減味壽胎丸總黃酮的提取工藝；利用UPLC-MS研究減味壽胎丸總黃酮中金絲桃苷和槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù),根據(jù)藥物達峰時間,制備含藥血清；原代培養(yǎng)人早孕蛻膜細胞,建立米非司酮損傷人早孕蛻膜細胞模型,并以此為載體,觀察含藥血清對細胞凋亡模型的影響。 方法： 1.優(yōu)化減味壽胎丸總黃酮的提取工藝：以蘆丁為對照品,利用比色法測定壽胎丸提取液中的總黃酮含量,采用單因素考察及正交試驗設(shè)計法優(yōu)選減味壽胎丸中總黃酮的回流提取工藝參數(shù)。 2.UPLC-MS同時測定減味壽胎丸中金絲桃苷和槲皮素：通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件,建立UPLC-MS方法,同時檢測減味壽胎丸提取液中的金絲桃苷和槲皮素。 3.大鼠血液中減味壽胎丸的金絲桃苷和槲皮素藥代動力學(xué)研究：(1)優(yōu)化液質(zhì)聯(lián)用條件,建立同時檢測大鼠血漿中減味壽胎丸的金絲桃苷和槲皮素的UPLC-MS方法。(2)SD雌鼠隨機分為3組,每組6只,分別灌予減味壽胎丸、金絲桃苷和槲皮素,灌藥后分別在5min、10min、20min、30min,45min、60min、90min、120min、240min、360min從眼眶靜脈叢采血0.5ml,分離得血漿,采用乙酸乙酯液-液提取方法進行樣品預(yù)處理,己烯雌酚作為內(nèi)標(biāo)。應(yīng)用優(yōu)化好的UPLC-MS方法測定大鼠血漿中金絲桃苷和槲皮素的含量,獲得藥時曲線和藥動參數(shù)。 4.人早孕蛻膜細胞凋亡模型的建立：應(yīng)用復(fù)合酶消化法分離人早孕蛻膜細胞,利用差時貼壁法純化人早孕蛻膜細胞。施加不同濃度的米非司酮于人早孕蛻膜細胞,通過細胞抑制率、早期凋亡率、caspase-3基因表達3個指標(biāo)評價人早孕蛻膜細胞凋亡的情況,確定適合造模的米非司酮濃度。 5.減味壽胎丸及其有效成分含藥血清對人早孕蛻膜細胞損傷模型的影響：SD雌鼠隨機分為6組,每組5只,分別予地屈孕酮、減味壽胎丸、菟絲子、金絲桃苷、槲皮素、生理鹽水灌胃,約在藥物達峰時間用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈采血,分離得到含藥血清。選取純度大于90%生長狀態(tài)良好的人早孕蛻膜細胞,予造模濃度的米非司酮干預(yù)后,施加制備好的含藥血清干預(yù)造模細胞,通過MTT法、流式細胞術(shù)、PCR和免疫印跡檢測相關(guān)指標(biāo),以觀察含藥血清對細胞模型的影響。 結(jié)果： 1.減味壽胎丸總黃酮的測定方法簡單可靠,標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1.205x, r=0.9998,蘆丁0.112～0.56mg/mL范圍內(nèi)線性良好。通過單因素考察和正交試驗設(shè)計得出回流提取減味壽胎丸總黃酮的最佳條件為：乙醇濃度為60%,料液比為1：10,回流提取2次,每次提取時間為0.5h。 2.建立了同時檢測減味壽胎丸中的金絲桃苷和槲皮素的UPLC-MS方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線r0.999,在0.25ug/ml-4ug/ml范圍,線性關(guān)系良好,精密度、回收率等均符合要求,測得減味壽胎丸提取液中的槲皮素和金絲桃苷分別為0.15mg/ml和1.98mg/ml. 3.血漿中金絲桃苷和槲皮素分別在5-5000、1-1000ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.9954),最低定量限(LLOQ)≤5ng/mL.日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于8.2%,相對誤差(RE)為-5%～6%。平均提取回收率為71%～83%范圍內(nèi),基質(zhì)效應(yīng)其均值處于94%～99%范圍內(nèi)。大鼠口服灌胃后金絲桃苷和槲皮素吸收快,Tmax均小于60min。從藥-時曲線可見復(fù)方組中的Cmax較單體組的高,生物利用度較高。 4.復(fù)合酶法分離得到人早孕蛻膜細胞,通過差時貼壁法純化至第3代,熒光免疫法鑒定角蛋白7為陰性,波形蛋白為陽性,泌乳素為陽性,純度大于90%；放射免疫法測定第1-10代細胞上清液均含有PRL,在第8代后細胞上清中PRL呈現(xiàn)遞減趨勢。在生長旺盛期,施加5個不同濃度的米非司酮,MTT法檢測生長抑制率,24h半數(shù)抑制濃度為8×10-mol/l:隨著米非司酮濃度的增加早期凋亡率、caspase-3基因表達均有增加。綜合評價后,確定人早孕蛻膜細胞凋亡造模濃度為6×10-mol/l,藥物作用時間為24h。 5.各組血清藥物干預(yù)人早孕蛻膜細胞凋亡模型后,與空白模型組比較,孕酮血清組、壽胎丸血清組、菟絲子血清組、金絲桃苷血清組和槲皮素血清組的生長抑制率、早期凋亡率、caspase一3凋亡基因表達均有所降低。 結(jié)論： 1.本研究優(yōu)化確定了減味壽胎丸總黃酮回流提取工藝,具有工藝簡單易行、穩(wěn)定性與重復(fù)性好、省時節(jié)能等特點。 2.建立了UPLC-MS同時測定減味壽胎丸提取液中金絲桃苷和槲皮素含量的方法。經(jīng)過驗證,精密度、回收率等均符合要求,是實現(xiàn)質(zhì)量控制的保障。 3.建立了檢測大鼠血漿中金絲桃苷和槲皮素的UPLC-MS分析方法,該方法樣品前處理過程簡單,分析時間短,專屬性、線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)等均符合要求,并成功地應(yīng)用于其藥代動力學(xué)研究。復(fù)方組生物利用增加,優(yōu)于單體組,說明復(fù)方中藥物間有協(xié)同作用,促進了有效成分金絲桃苷和槲皮素的吸收。 4.原代培養(yǎng)人早孕蛻膜細胞,建立了米非司酮誘導(dǎo)人早孕蛻膜細胞凋亡的模型,以此為載體,研究了減味壽胎丸及其有效成含藥血清對人早孕蛻膜細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示減味壽胎丸及有效成分可不同程度抑制人早孕蛻膜凋亡
[Abstract]:Objective:
The extraction technology of total flavone was optimized by single factor investigation and orthogonal design, and the pharmacokinetic parameters of Hyperoside and quercetin in the total flavones of Shou Shou fetal pill were studied by UPLC-MS. In the early pregnancy decidua cells, a model of mifepristone damaging the decidual cells of human early pregnancy was established and used as a carrier to observe the effect of serum containing drugs on the apoptosis model.
Method錛，

本文編號：1800261