本文選題：脂多糖 + 膿毒癥　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：膿毒癥(Sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,是目前重癥醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。內(nèi)皮細(xì)胞激活、功能障礙和損傷是嚴(yán)重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要特征。內(nèi)皮通透性增高所致微血管滲漏是嚴(yán)重膿毒癥和MODS的重要病理生理,也是膿毒癥休克頑固性低血壓的原因之一。 內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管通透性增加的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。膿毒癥誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì)及其他損傷因子的釋放,損害內(nèi)皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和完整性受到破壞,引起血管通透性增加。最近有研究證明,線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)激活在血管通透性增加的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑凋亡即各種因素導(dǎo)致線(xiàn)粒體受損,線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)變孑L(mPTP)開(kāi)放,通過(guò)釋放Cytochrome C及SMAC等小分子凋亡促進(jìn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),通過(guò)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而激活Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。激活的Caspase-3可以裂解眾多底物,其中包括內(nèi)皮間鏈接蛋白β-catenui。 β-catenin鏈接了細(xì)胞骨架蛋白Actin與VE-cadherin,裂解β-catenin導(dǎo)致Actin與VE-cadherin鏈接斷裂從而使得內(nèi)皮間鏈接打開(kāi),血管通透性增加。在線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑凋亡信號(hào)中,線(xiàn)粒體起著關(guān)鍵調(diào)控作用,各種損傷因子導(dǎo)致線(xiàn)粒體受損,功能障礙,最終引起線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mPTP)開(kāi)放,mPTP的開(kāi)放導(dǎo)致小分子的物質(zhì)釋放,引起線(xiàn)粒體膜電位(△Ym)丟失,線(xiàn)粒體腫脹、功能障礙,ATP合成障礙。在線(xiàn)粒體損傷的眾多因素中,氧自由基是最為重要的一個(gè)。線(xiàn)粒體是活性氧產(chǎn)生的重要部位,病理情況下,氧自由基清除功能降低,而生成系統(tǒng)活性增強(qiáng),氧自由基便大量產(chǎn)生堆積,從而損傷細(xì)胞。一方面氧自由基可以直接損傷線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)及線(xiàn)粒體DNA,另一方面活性氧還可調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達(dá)。Bcl-2家族蛋白由抗凋亡如Bcl-2, Bcl-XL和促凋亡成員如Bax, Bak組成,這些成員之間通過(guò)相互協(xié)同作用調(diào)節(jié)了線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后,Bax發(fā)生構(gòu)象變化,通過(guò)在線(xiàn)粒體外膜上齊聚形成脂質(zhì)孔,使得線(xiàn)粒體外膜通透性增加,引起細(xì)胞色素C等蛋白釋放及導(dǎo)致下游caspases激活。Bcl-2家族抗凋亡蛋白成員通過(guò)與促凋亡蛋白成員Bax和Bak形成異源二聚體而抑制Bax和Bak的促凋亡作用,從而維持線(xiàn)粒體膜穩(wěn)定。 目前臨床上尚無(wú)明顯改善血管通透性增高的有效治療手段或藥物,在膿毒癥導(dǎo)致的微血管滲漏進(jìn)而引起血管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移而休克的治療中,大多采用基于液體治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行病因治療,但是效果甚微而慢,并且在血管通透性增加未得到改善的時(shí)候,大量補(bǔ)液反而加重水腫,進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙。因此,探索尋求一種可減輕炎癥反應(yīng),降低血管通透性,進(jìn)而改善微循環(huán)的藥物具有十分重要的意義。 虎杖苷(polydatin, PD)是虎杖的有效活性成分,其化學(xué)名為3,4’,5.三羥基芪-3-13-D-單葡萄糖苷(3,4,5-trihydroxystilbene-3-B-mono-D-glucoside) c經(jīng)過(guò)30年的研究,表明PD可以改善休克微循環(huán),抑制白細(xì)胞粘附,具有顯著的抗炎抗氧化作用。近年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室證明PD可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激,穩(wěn)定溶酶體,抑制mPTP開(kāi)放而保護(hù)線(xiàn)粒體。因此假設(shè)PD可以通過(guò)抑制線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑凋亡信號(hào)而改善內(nèi)毒素(LPS)介導(dǎo)的血管通透性增加。目的 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體水平研究虎杖苷對(duì)LPS介導(dǎo)的大鼠腸系膜微靜脈血管通透性增高以及離體水平研究虎杖苷對(duì)LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(]HUVECs)通透性增高的影響,探討虎杖苷在膿毒癥中血管通透性增加的作用。并通過(guò)研究虎杖苷對(duì)LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)的影響,探討虎杖苷抑制LPS介導(dǎo)的血管通透性增高的機(jī)制。 方法 1.LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)通透性增高 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(control group),不同濃度內(nèi)毒素(0.1、1.0、5.0、10.0mg/L)刺激組。分別給予PBS及0.1、1.0、5.0、10.0mg/L LPS刺激HUVECs,通過(guò)每30min檢測(cè)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TER)觀察LPS對(duì)HUVECs通透性的影響。2.PD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs通透性增加的影響 PD對(duì)LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)通透性增高的影響：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(control group).內(nèi)毒素+平衡鹽溶液組(LPS+PBS group).內(nèi)毒素+低劑量虎杖苷組(LPS+low-dose PD group).內(nèi)毒素+中劑量虎杖苷組(LPS+medium-dose PD group)及內(nèi)毒素+高劑量虎杖苷組(LPS+high-dose PD group).不同劑量虎杖苷處理組分別在予以終濃度虎杖苷1、10及100μmol/L預(yù)處理60min后給予LPS5mg/L的刺激。通過(guò)每15min測(cè)量一次跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TER)檢測(cè)60min內(nèi)PD對(duì)LPS介導(dǎo)的HUVEC通透性增高的影響.3.PD對(duì)LPS介導(dǎo)的HUVECs線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)的影響 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(control group)、內(nèi)毒素+平衡鹽溶液組(LPS+PBS group).內(nèi)毒素+虎杖苷組(LPS+PD group)�；⒄溶罩委焺┝扛鶕�(jù)PD對(duì)LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)通透性增高的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用預(yù)處理終濃度為10μmol/L.通過(guò)過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)試劑盒檢測(cè)HUVECs中氧化應(yīng)激水平；蛋白免疫印跡法檢鋇HUVECs中BAX蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)改變；熒光素—熒光素酶試劑盒來(lái)檢測(cè)HUVECs線(xiàn)粒體ATP水平；JC-1探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體跨膜電位(△Ψm)的變化,用發(fā)射的綠色熒光的JC.1單體(低△Ψm細(xì)胞)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%)來(lái)說(shuō)明HUVECs線(xiàn)粒體去極化比例；細(xì)胞色素C凋亡試劑盒檢測(cè)HUVECs細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量；caspsse-3活性分析試劑盒檢測(cè)HUVECs中caspsse-3活性。 4.PD對(duì)內(nèi)毒素介導(dǎo)的腸系膜微靜脈血管通透性增高的影響 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(control group),內(nèi)毒素+生理鹽水組(LPS+NS group),內(nèi)毒素+虎杖苷組(LPS+PD group).大鼠麻醉后,股靜脈及動(dòng)脈置管,通過(guò)靜脈給予LPS10mg/kg,并通過(guò)股動(dòng)脈監(jiān)測(cè)大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP),虎杖苷組大鼠在LPS注射后立即給予虎杖苷45mg/kg治療。3小時(shí)后,剖腹并在正置熒光顯微鏡、實(shí)驗(yàn)室分析軟件ⅡS.Element BR觀察分析1小時(shí)內(nèi)小腸系膜微靜脈熒光白蛋白滲出情況,并計(jì)算熒光值變化即△I=1-(Ii-Io)/Ii,其中Ii代表血管內(nèi)平均熒光強(qiáng)度,I0代表血管外平均熒光強(qiáng)度,△I越大通透性越高。 結(jié)果 1.LPS介導(dǎo)的HUVECs通透性增加的濃度和時(shí)間效應(yīng) 為了檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)HUVECs通透性的影響,本研究分別采用了0、0.1、1.0、5.0、10.0mg/L等濃度的LPS刺激HUVECs,通過(guò)每30min檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞跨膜電阻(TER)可見(jiàn),0.1mg/L的LPS并不引起HUVECs通透性的明顯增加,而1.0、5.0、10.0mg/L均可引起HUVECs通透性的顯著增加,并且均在60min達(dá)到峰值后維持穩(wěn)定,在60min時(shí),5.0及10.0mg/L LPS組TER明顯低于1.0mg/L LPS組,而5.0與10.0mg/L LPS組間無(wú)明顯差異。 2.PD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs通透性增加的影響 分別以1、10、100μmol/L的PD提前60min預(yù)處理HUVECs后,給予終濃度為5.0mg／L的LPS刺激,在60min內(nèi)每15min檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞TER,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),LPS刺激后HUVECs通透性明顯增加,而給予1、10、100μmol/L的PD預(yù)處理組中,可見(jiàn)TER不同程度增加,即通透性不同程度降低。其中10、100gmol/L的PD預(yù)處理組中可見(jiàn)TER明顯增加。在60min時(shí),10、100μmol/L的PD預(yù)處理組中TER均明顯高于PBS組及1μmol/L PD處理組(P0.01或者P0.05),提示10、100μmol/L的PD預(yù)處理可以顯著改善LPS誘導(dǎo)的HUVECs通透性增加,而通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)10與100μmol/L兩組間TER無(wú)明顯差異(P0.05)。 3.PD對(duì)HUVECs中過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)的影響 為了檢測(cè)氧化應(yīng)激在LPS介導(dǎo)的HUVECs通透性增加以及PD的干預(yù)作用,本研究采用了LPO試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中LPO含量。結(jié)果顯示LPS刺激60min后HUVECs中LPO含量明顯高于對(duì)照組,為對(duì)照組的177±21%(P0.05)；而PD預(yù)處理組中HUVECs LPO含量為對(duì)照組的130±16%,較PBS組顯著降低(P0.05)。提示LPS引起HUVECs氧化應(yīng)激,而PD可以顯著抑制氧化應(yīng)激。 4.PD對(duì)HUVECs BAX蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 Bcl-2家族蛋白對(duì)于線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的調(diào)控尤為重要,而B(niǎo)cl-2家族蛋白主要包括促凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl等,以及抗凋亡蛋白BAX.BAD等。通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)可見(jiàn),PBS組中促凋亡蛋白BAX表達(dá)明顯提高,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P0.05),提示LPS誘導(dǎo)HUVECs中Bcl-2蛋白家族表達(dá)異常,促進(jìn)HUVECs凋亡；而PD組中可見(jiàn)BAX表達(dá)較PBS組明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)較PBS組顯著增加(P0.05),提示PD可以顯著改善LPS誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白家族表達(dá)異常,從而抑制HUVECs凋亡。 5.PD對(duì)HUVECs線(xiàn)粒體膜電位(△Ψm)的影響 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光探針JC-1標(biāo)記的HUVECs線(xiàn)粒體膜電位(△Ψm)的改變。PD對(duì)HUVECs線(xiàn)粒體膜電位(△Ψm)的影響JC-1是一種電位敏感性熒光探針,在正常線(xiàn)粒體以聚合體形式存在,發(fā)橘紅色熒光,提示線(xiàn)粒體處于極化狀態(tài)；在疾病等情況下,JC-1以單體形式存在,發(fā)綠色熒光,提示線(xiàn)粒體去極化,跨跨膜電位減低。計(jì)數(shù)JC-1單體(綠色熒光)標(biāo)識(shí)的低△Ψm細(xì)胞的比例。對(duì)照組中,低△Ψm細(xì)胞的比例為11.3±3.0%；PBS組中低△Ψm細(xì)胞的比例為27.5±5.1%,較對(duì)照組顯著提高(P0.05),提示LPS刺激引起線(xiàn)粒體膜電位下降；PD組中低△Ψm細(xì)胞的比例為17.3±3.6%較PBS組明顯降低(P0.05),提示PD顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降。 6.PD對(duì)HUVECs ATP含量的影響 ATP是線(xiàn)粒體功能評(píng)價(jià)的直接指標(biāo)。本研究采用CellTiter-GlO熒光素酶生物發(fā)光法,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量。結(jié)果顯示,PBS組中ATP含量較對(duì)照組顯著降低(P0.05),為對(duì)照組的43.7±19.0%,提示PBS介導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷引起ATP合成降低；PD組中ATP含量較PBS組顯著提高(P0.05),為對(duì)照組的82±13.7%,提示PD抑制LPS誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷。 7.PD對(duì)HUVECs線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C釋放的影響 細(xì)胞色素C是存在于線(xiàn)粒體中的蛋白,線(xiàn)粒體損傷致使通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放后,細(xì)胞色素C由線(xiàn)粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而引起細(xì)胞凋亡。通過(guò)細(xì)胞色素C凋亡試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在對(duì)照組中,細(xì)胞色素C含量甚微,而LPS刺激后,引起線(xiàn)粒體損傷及通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放,導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放而使得細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量明顯增加；蛋白免疫印跡結(jié)果顯示PD組中細(xì)胞色素C含量較PBS組明顯降低,幾乎恢復(fù)正常,提示PD可以通過(guò)保護(hù)線(xiàn)粒體顯著抑制細(xì)胞色素C的釋放,從而抑制細(xì)胞凋亡。 8.PD對(duì)HUVECs caspsse-3活性的影響 凋亡信號(hào)激活后,細(xì)胞色素C等蛋白由線(xiàn)粒體釋放進(jìn)入胞漿,從而激活下游caspases,其中caspase-3是比較重要的凋亡執(zhí)行蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用試劑盒熒光分析法檢測(cè)HUVECs中caspase-3活性變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PBS組中caspase-3活性較對(duì)照組顯著提高,為對(duì)照組的221±29%；PD組中caspase-3活性較PBS組顯著提高,為對(duì)照組的175±21%,提示PD抑制LPS介導(dǎo)的caspase-3激活。 9.PD減輕LPS大鼠的腸系膜微靜脈血管滲漏 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,用PowerLab//8sp監(jiān)測(cè)三組大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)發(fā)現(xiàn)組間血壓沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)同等外周環(huán)境條件下在體實(shí)驗(yàn)觀察異硫氰酸熒光素標(biāo)志的白蛋白在腸系膜毛細(xì)血管內(nèi)外的熒光密度值對(duì)比,結(jié)果顯示LPS可引起微血管,尤其是毛細(xì)血管后微靜脈滲透性顯著增高,而LPS+PD治療組熒光蛋白外滲情況較LPS+NS對(duì)照組減輕,測(cè)定的T60的Io值,正常對(duì)照組為0.21±0.14,LPS+NS組上升為0.60±0.09(P0.01),LPS+PD組為0.34±0.05(P0.01),兩組LPS組間對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 結(jié)論 1.虎杖苷抑制LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高； 2.虎杖苷通過(guò)抑制線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)改善LPS介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高； 3.虎杖苷抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠腸系膜微靜脈血管通透性增高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1789452