本文選題：低能量體外沖擊波 + 脂肪干細胞　； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景糖尿病是人類常見的慢性疾病,會引起神經(jīng)、血管的病變,導致一系列的并發(fā)癥,主要有高血壓和心臟病變,晚期可并發(fā)視網(wǎng)膜病變、末梢血管病變、外周神經(jīng)病變甚至內(nèi)臟器官的損害(比如糖尿病腎病)等。而在泌尿系統(tǒng)的其他并發(fā)癥中,膀胱功能障礙(diabetic bladder dysfunction, DBD)作為一種常見并發(fā)癥,大約在所有糖尿病患者中占80%左右。DBD主要表現(xiàn)為儲尿期和排尿期癥狀,并不會對患者的生命有威脅,但對患者的生活質(zhì)量影響甚巨。目前,針對DBD的治療方法主要是以緩解其癥狀為主,并不能對其進行有效的治療,所謂治標不治本。近些年來,各研究人員都在竭力尋找治療DBD的有效方法,在這個時候,脂肪組織來源干細胞(adipose tissue derived stem cells, ADSCs)的移植治療進入了人們的視野。ADSCs是類似于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)的一種干細胞,同樣具有潛能可多向分化為脂肪細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等,同時,由于脂肪在體內(nèi)含量豐富且極易獲取,因此,獲取脂肪提取ADSCs進行研究,已經(jīng)是組織修復醫(yī)學中的一個熱點研究方向。在既往的研究中,有學者發(fā)現(xiàn)ADSCs對受損的大鼠盆腔神經(jīng)節(jié)有很好的修復作用,而且可以應用于勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)的治療中,它能夠促進受損海綿體神經(jīng)的修復。對于ADSCs發(fā)揮作用的機制,目前的研究仍尚未得出明確的結(jié)論,近期的研究認為ADSCs的旁分泌功能可能是其發(fā)揮作用的重要途徑。在上個世紀90年代起,體外沖擊波治療(shock wave therapy, SWT)就已經(jīng)被應用于泌尿系結(jié)石的治療。而隨著科技及社會的進步,SWT的應用越來越廣泛,非聚焦低能量體外沖擊波(defocused low-energy shock wave, DLSW)在組織修復領(lǐng)域的應用亦被越來越多的研究人員關(guān)注,而既往有研究報道了DLSW對糖尿病相關(guān)并發(fā)癥(糖尿病潰瘍或軟組織損傷等)的治療效應。關(guān)于DLSW發(fā)揮治療效應過程中存在的機制,已有的研究都無法很好地進行解釋。在關(guān)于其治療機制的學說中,我們越來越傾向于DLSW對干細胞的募集和促進作用,這個學說是假設DLSW可以激活干細胞、促進干細胞向受損部位募集、增強干細胞發(fā)揮的作用,但其中涉及的機制也仍不清楚。因此,為了更好的探討DBD的有效治療方法,本研究將ADSCs和.DLSW同時應用于治療DBD大鼠,來探討其治療效應及可能存在的治療機制。目的探討DLSW對ADSCs的影響和作用,以及其作用過程中可能存在的機制；同時,將DLSW和ADSCs用于治療DBD大鼠的效果,在治療過程中DLSW對ADSCs的促進作用。材料和方法1、細胞實驗(1) ADSCs的分離培養(yǎng)：提取雌性SD大鼠腹部性腺周圍的脂肪,應用3%戊巴比妥對大鼠進行全身麻醉,常規(guī)給大鼠備皮后,碘伏消毒、鋪洞巾,取大鼠下腹正中切口,取其性腺周圍的脂肪2-3m1放入冰的PBS中,縫合大鼠腹部切口。采用膠原酶I進行消化脂肪,分離出ADSCs,置于細胞專用培養(yǎng)基中,在設定為37℃、5%CO2條件的細胞孵育箱中培養(yǎng)。2天后,去除仍未貼壁的細胞,并更換細胞培養(yǎng)基,而后每3天更換細胞培養(yǎng)基一次,當細胞生長至覆蓋住培養(yǎng)瓶90%以上的空間時,予以傳代。(2) DLSW治療：每次細胞傳代前,將培養(yǎng)的ADSCs置于SWT機器下,進行DLSW治療,記為治療組ADSCs,同時,將未進行DLSW治療的細胞記為對照組ADSCS。于裝有貼壁ADSC的培養(yǎng)瓶表面涂抹超聲凝膠,將之置于沖擊波治療探針下方并與之接觸,用EFD為0.1mJ/mm2能量的DLSW以120次／分鐘的頻率對ADSCs進行治療。DLSW治療后24小時,無菌條件下進行細胞傳代。治療組ADSCs一共接受DLSW治療5次。(3)兩組細胞在每次傳代后均進行細胞形態(tài)學上的檢測對比,并用鬼筆環(huán)肽進行細胞骨架染色,以進一步比較兩組細胞的差異。(4) ELISA檢測：每次體外沖擊波治療完成后,將治療組ADSC和對照組ADSC的培養(yǎng)基均更換為3ml不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。24小時后,將培養(yǎng)基收集至EP管中,1200rpm離心10分鐘后,置入-80℃冰箱中保存,以待不同代的培養(yǎng)基收集齊全后同時進行檢測。為消除偏差,兩組細胞的培養(yǎng)基應同時收集、儲存并同時檢測。利用ELISA試劑盒檢測治療組和對照組的大鼠ADSC培養(yǎng)基(P1～P5)中的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)和CXC配體5(CXC ligand 5, CXCL5)的水平。兩組細胞均采用第4代細胞進行進一步實驗。(5)流式細胞術(shù)檢測：選擇P4的治療組ADSC和對照組ADSC同時進行流式細胞術(shù)檢測,以觀察其細胞表面抗原的變化。檢測細胞表面抗原包括CD34、Stro-1、 OCT、CD106、CD29和CD49d。(6)細胞增殖能力檢測：為了檢測細胞的增殖功能,將P4期的ADSCs應用EdU進行標記過夜,然后采用EdU細胞增殖檢測試劑盒進行檢測。應用EdU標記細胞法來檢測DLSW對ADSCs增殖能力的促進作用。同時,應用Western blot檢測細胞增殖指標——增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和Ki67蛋白的表達水平。(7)細胞遷移能力檢測：檢測兩組細胞CXCR2的表達水平及細胞遷移能力。為了檢測細胞的遷移功能,首先檢測P4期的治療組和對照組的細胞中CXCR2蛋白的變化。采用免疫熒光染色和Western blot兩種方法來檢測CXCR2的表達水平。細胞遷移實驗中,采用趨化因子CXCL5作為誘導劑,誘導細胞進行遷移。(8)應用Western blot檢測兩組細胞內(nèi)的細胞傳導通路的變化,包括MAPK信號通路、JAK/STAT信號通路、PI-3K/AKT信號通路和NF-κB信號通路的變化。另一方面,采用相應的信號通路阻斷劑進行干預后,再檢測兩組細胞的分泌功能和增殖功能的變化。2、動物實驗(1)實驗設計。隨機選擇10只大鼠,拿來當做正常對照組(N組),喂養(yǎng)普通食物；另外選取30只作為糖尿病組,首先給予高脂肪飲食(high fat diet, HFD)喂養(yǎng)30天,然后分2次按30mg/kg經(jīng)大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),間隔時間為1周。整個實驗過程,兩組大鼠的喂養(yǎng)食物不變。糖尿病大鼠需要定時記錄其空腹血糖,當大鼠的空腹血糖≥7.8mmol/L后,且多次測量均維持在此水平,才能繼續(xù)進行下一步的實驗。注射STZ后3個月,在30只糖尿病大鼠中,隨機選取20只大鼠經(jīng)腹腔獲取脂肪,用來提取、培養(yǎng)ADSCS。為了進行ADSCs的體內(nèi)追蹤,應采用10μM的EdU對ADSCs進行過夜標記,然后計數(shù)出3×106個細胞,用0.5ml的PBS稀釋后,經(jīng)尾靜脈注射回大鼠體內(nèi)。隨機將這30只糖尿病大鼠分成3組：第1組,經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.5ml的PBS,不做其他處理(糖尿病對照組,DM組,n=10)；第2組,經(jīng)大鼠尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射0.5ml PBS稀釋的3×106個自體ADSCs,不做其他處理(ADSC組,n1=10)；第3組,經(jīng)大鼠尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射0.5ml PBS稀釋的3×106個自體ADSCs后,第2天即予以DLSW沖擊大鼠腹部(ADSC+SW組,,1=10)。此外,正常對照組(N組)的大鼠也應該在同時經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.5ml的PBS。(2)清醒狀態(tài)下測定大鼠的膀胱內(nèi)壓。進行膀胱內(nèi)壓測定前24小時,分別向膀胱內(nèi)和腹腔中各留置一根聚乙烯-90導管(導管一端連接乳膠球囊)用來測量膀胱內(nèi)壓和腹腔壓力。為了排除大鼠自身膀胱活動的影響,在正式記錄壓力數(shù)據(jù)前,應該讓大鼠先適應一段時間再正式測定,測量膀胱內(nèi)壓時需要持續(xù)1小時,記錄測定的數(shù)值進行后續(xù)分析。(3)膀胱組織中EdU標記的ADSCs的定量和細胞凋亡的定量。為檢測ADSCs募集至膀胱損傷組織中的情況,我們用EdU標記的ADSCs在評估組織中的定量(即高倍鏡視野中EdU陽性ADSCs的數(shù)目)來表示,我們先在熒光顯微鏡的高倍鏡視野中觀察EdU陽性ADSCs并采集圖像,然后借助Image-Pro Plus軟件來計算EdU陽性的ADSCs數(shù)目。為檢測經(jīng)DLSW治療后膀胱組織切片中細胞凋亡的情況,我們采用TUNEL試劑盒染色來檢測細胞的凋亡,然后在熒光顯微鏡下進行觀察,并借助Image-Pro Plus軟件分析凋亡細胞的數(shù)目。(4)免疫熒光染色和免疫組織染色。3、統(tǒng)計學分析收集各組實驗數(shù)據(jù),使用SPSS 19.0軟件對其進行統(tǒng)計學分析。應用單因素方差分析來分析各組之間的連續(xù)型數(shù)據(jù)的比較,而各組大鼠的膀胱功能改善情況則利用Fisher卡方檢驗進行比較。本研究中的所有數(shù)據(jù)均采用(平均值±標準差)來表示。只有當P0.05時,才代表兩組間的差異具有統(tǒng)計學差異。結(jié)果1、細胞實驗(1)經(jīng)DLSW治療的ADSCs與未經(jīng)治療的ADSCs的形態(tài)并無明顯差別,細胞骨架染色亦未見明顯變化,說明DLSW并無破壞ADSCs的形態(tài)特征。(2)流式細胞檢測中,經(jīng)DLSW治療的ADSCs與未經(jīng)治療的ADSCs表達CD34、 Stro-1、OCT4、 CD106、CD29和CD49d的水平均未見明顯差異,表明DLSW并未改變ADSCs的細胞表型。(3) DLSW可增強ADSCs的分泌功能。分泌功能實驗中,可見與未經(jīng)治療的ADSCs組對比,經(jīng)DLSW治療的ADSCs組中VEGF、NGF和CXCL5的分泌濃度均顯著增加。(4) DLSW可促進ADSCs的增殖功能。在Western blot檢測中,經(jīng)DLSW治療的ADSCs表達PCNA和Ki67的水平均比未經(jīng)治療的ADSCs明顯升高。而在EdU試劑盒檢測實驗中,可見在經(jīng)DLSW治療的ADSCs組中,EdU標記的ADSCs數(shù)較未經(jīng)治療的ADSCs明顯增多。(5) DLSW不僅可以促進ADSCs的體外遷移,并且可以增強ADSCs在體內(nèi)的遷移能力。在體外遷移實驗中,經(jīng)DLSW治療的ADSCs組中遷移至下室的細胞明顯比未經(jīng)治療的ADSCs組多。(6) DLSW是通過MAPK信號通路、PI-3K/AKT信號通路和NF-κB信號通路來激活ADSCs的,通過阻斷實驗,可以看出,阻斷通路后,ADSCs的分泌能力和增殖能力明顯減弱。2、動物實驗(1)測定膀胱內(nèi)壓實驗中,注射經(jīng)DLSW治療的ADSCs的大鼠中,有70%大鼠的膀胱功能恢復至正常水平,其余的亦有不同程度的好轉(zhuǎn),而在對照組中,僅有40%大鼠的膀胱功能恢復至正常水平。說明DLSW亦可輔助ADSCs促進膀胱功能的恢復。(2)大鼠膀胱組織中EdU標記細胞的定量。注射ADSCs后1個月,切取膀胱組織行EdU染色,檢測膀胱內(nèi)EdU標記的ADSCs的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn),EdU陽性的細胞在膀胱粘膜下層和肌層中均能觀察到(圖9A)。在ADSC+SW組大鼠的膀胱組織切片中,膀胱粘膜下層中EdU陽性的細胞數(shù)目較ADSC組明顯增多；而在肌層中的EdU陽性的細胞數(shù)目,兩組并無明顯差異。(3)細胞凋亡的定量檢測。應用TUNEL試劑盒測量細胞凋亡,只有TUNEL和DAPI同時陽性的細胞核才是凋亡細胞核。DM組大鼠中的細胞凋亡數(shù)目較N組明顯增多(P0.05)。而在ADSC組和ADSC+SW組大鼠的膀胱組織切片中,膀胱粘膜層的凋亡細胞較DM組明顯減少(P0.05)。(4)血管的定量檢測。在N組大鼠中,膀胱粘膜下層可見豐富的eNOS陽性的血管、連續(xù)致密的Col IV表達陽性的毛細血管網(wǎng)。而在DM組大鼠的膀胱粘膜下,上述血管的密度減少,毛細血管網(wǎng)絡毛細血管網(wǎng)絡不再連續(xù)、陽性表達量下降。在ADSC組和ADSC+SW組中,血管的分布以及毛細血管網(wǎng)的連續(xù)性和厚度較DM組均有明顯改善,而且,ADSC+SW組的改善效果更佳。結(jié)論DLSW通過MAPK信號通路、PI-3K/AKT信號通路和NF-κB信號通路來激活ADSCs,以促進ADSCs的分泌、增殖和遷移功能,且并不會改變ADSCs的形態(tài)以及表型。此外,DLSW可以通過激活ADSCs的作用來發(fā)揮作用,改善DBD大鼠的膀胱功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 雙衛(wèi)兵;王東文;;糖尿病膀胱研究進展[J];中華泌尿外科雜志;2006年03期

，

本文編號：1788270