本文選題：缺血/再灌注 + 預(yù)處理��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：近年來(lái)缺血性腦卒中發(fā)病率、致死率以及致殘率均居高不下，已成為導(dǎo)致人類(lèi)死亡的“第二大殺手”。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的主要病理生理機(jī)制之一，抑制氧化應(yīng)激能夠有效減輕缺血再灌注損傷。作為體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成，內(nèi)源性/外源性激活SOD2能夠有效減輕氧化應(yīng)激。SOD2也是諸多非缺血預(yù)處理措施誘導(dǎo)腦保護(hù)效應(yīng)的靶點(diǎn)之一。作為非缺血預(yù)處理的重要組成，電針預(yù)處理因其安全性高、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是潛在的可靠防護(hù)缺血性腦卒中有效措施，而且其作用機(jī)制也被證實(shí)同樣與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)。但電針預(yù)處理是否也通過(guò)激活SOD2信號(hào)發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)并不明確，而且電針預(yù)處理調(diào)控SOD2激活的上游信號(hào)機(jī)制也尚未清楚。 基于前期研究，為解決上述問(wèn)題，本課題將重點(diǎn)回答：1.電針預(yù)處理是否通過(guò)上調(diào)SOD2表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受；2.氧化應(yīng)激損傷是造成缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，電針預(yù)處理激活SOD2是否通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)？3. STAT3已被報(bào)道證實(shí)為SOD2的上游調(diào)控分子，我們前期研究證實(shí)電針預(yù)處理通過(guò)CB1受體調(diào)節(jié)STAT3磷酸化，那么電針預(yù)處理對(duì)STAT3/SOD2的調(diào)控是否也由CB1受體介導(dǎo)？ 實(shí)驗(yàn)一電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)的影響 目的 明確電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)的影響 方法 將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組：假手術(shù)組（sham組）、單純電針組（EA組）、模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）。Sham組：腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，行假手術(shù)；EA組：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取“百會(huì)穴”，疏密波、2/15Hz、1mA，持續(xù)電刺激30min，電針2h后取材；MCAO組：麻醉后進(jìn)行MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌；EA+MCAO組：麻醉后取“百會(huì)穴”，持續(xù)電針30min，電針后2h進(jìn)行MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1h后進(jìn)行再灌。 所有小鼠將于缺血再灌注2h后取材，進(jìn)行western-blot、免疫熒光檢測(cè)SOD2表達(dá)變化情況。 結(jié)果 1.電針預(yù)處理上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后SOD2蛋白表達(dá)Western-blot顯示缺血再灌注2h后，與sham組相比，EA組SOD2表達(dá)無(wú)明顯變化，而MCAO組SOD2表達(dá)明顯下降（P0.05）；與MCAO組相比， EA+MCAO組SOD2表達(dá)明顯升高（P0.05）。 2.電針預(yù)處理增強(qiáng)神經(jīng)元SOD2免疫熒光強(qiáng)度免疫熒光結(jié)果顯示，缺血再灌注2h后，與sham組相比，EA組SOD2免疫熒光 本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證電針預(yù)處理是否影響腦缺血再灌注損傷后SOD2的表達(dá)。其次，研究電針預(yù)處理對(duì)SOD2激活的上游調(diào)控機(jī)制：探尋電針預(yù)處理是否通過(guò)CB1受體介導(dǎo)STAT3上調(diào)SOD2表達(dá)，激活抗氧化系統(tǒng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，最終發(fā)揮腦保護(hù)作用。從而為電針等非缺血性預(yù)處理腦保護(hù)措施分子機(jī)制揭示做出貢獻(xiàn)，也為其臨床應(yīng)用推廣提供更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)。強(qiáng)度無(wú)明顯改變，而MCAO組SOD2免疫熒光減弱；與MCAO組相比，電針預(yù)處理則增加了SOD2免疫熒光強(qiáng)度，SOD2與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN重疊增加。 結(jié)論 電針預(yù)處理可以上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元SOD2的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二 電針預(yù)處理上調(diào)SOD2減輕氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)腦缺血耐受 目的 1.驗(yàn)證SOD2-siRNA下調(diào)SOD2表達(dá)是否逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化作用 2.驗(yàn)證SOD2-siRNA是否逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng) 方法 1.驗(yàn)證SOD2-siRNA干擾效能 將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組：對(duì)照組（sham組）、溶劑組（vehicle組）、SOD2-siRNA組、control siRNA組。Sham組：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，僅行假手術(shù)；SOD2-siRNA組、control siRNA組、vehicle組：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分別給予側(cè)腦室注射SOD2-siRNA、control siRNA和溶劑。側(cè)腦室注射72h后，取缺血半暗帶相應(yīng)位置進(jìn)行western-blot。 2. SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化效應(yīng) 將48只雄性C57BL/6小鼠分為6組：假手術(shù)組（sham組）、單純電針組（EA組）、模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）、SOD2-siRNA組（EA+SOD2-siRNA組）、control siRNA組（EA+control siRNA組），其中sham組、MCAO組、EA組、EA+MCAO組處理方法如前所述；EA+SOD2-siRNA組、control siRNA組：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分別進(jìn)行側(cè)腦室注射SOD2-siRNA、control siRNA，72h后進(jìn)行MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌。缺血再灌注24h后，取缺血半暗帶進(jìn)行Elisa檢測(cè)，測(cè)定ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量，以及DHE染色觀察超氧陰離子表達(dá)情況。 3. SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng) 將36只雄性C57BL/6小鼠分為6組：假手術(shù)組（sham組）、單純電針組（EA組）、模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）、SOD2-siRNA組（EA+SOD2-siRNA組）、control siRNA組（EA+control siRNA組），，其處理方法如前所述。缺血再灌注24h后取材，進(jìn)行TTC染色、腦梗死容積百分比、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（Longa評(píng)分）、TUNEL染色。 結(jié)果 1. SOD2-siRNA明顯下調(diào)小鼠腦內(nèi)SOD2表達(dá) Western-blot結(jié)果顯示與sham組相比，vehicle組和control siRNA組SOD2表達(dá)無(wú)明顯變化，而SOD2-siRNA組SOD2表達(dá)明顯下降（P0.05）。 2. SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化效應(yīng) Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示：與sham組相比，MCAO組ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量均明顯升高（P0.05）；與MCAO組相比， EA+MCAO組ROS、MDA、8-OH-dG、nitrotyrosine含量均明顯降低（P0.05）；而與EA+MCAO組相比，EA+SOD2-siRNA組ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量均明顯升高（P0.05）。 DHE染色結(jié)果與Elisa結(jié)果相一致，與sham組相比，MCAO組超氧陰離子熒光強(qiáng)度明顯增加；與MCAO組相比，EA+MCAO組熒光強(qiáng)度明顯降低；與EA+MCAO組相比，而EA+SOD2-siRNA組熒光強(qiáng)度明顯增加。 3. SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng) 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：與MCAO組相比， EA+MCAO組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低（P0.05）；與EA+MCAO組相比，而EA+SOD2-siRNA組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯升高（P0.05）。腦梗死容積百分比：與MCAO組相比， EA+MCAO組的腦梗死容積百分比明顯減�。≒0.05）；與EA+MCAO組相比，EA+SOD2-siRNA組腦梗死容積百分比明顯增大（P0.05）。TUNEL染色:與MCAO組相比，EA+MCAO組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P0.05）；與EA+MCAO組相比，EA+SOD2-siRNA組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯升高（P0.05）。 結(jié)論 電針預(yù)處理通過(guò)上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制缺血后神經(jīng)元凋亡從而誘導(dǎo)腦缺血耐受。 實(shí)驗(yàn)三電針預(yù)處理通過(guò)CB1受體介導(dǎo)STAT3磷酸化上調(diào)SOD2 目的 1.驗(yàn)證大麻素CB1受體在電針預(yù)處理上調(diào)缺血再灌注損傷后SOD2表達(dá)中的作用 2.明確轉(zhuǎn)錄因子STAT3在電針預(yù)處理上調(diào)缺血再灌注損傷后SOD2表達(dá)中的作用 方法 1. CB1受體抑制劑AM251、SR141716對(duì)電針預(yù)處理后SOD2表達(dá)的影響 將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組：模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）、AM251預(yù)處理組（EA+AM251組）、SR141716預(yù)處理組（EA+SR141716組）、溶劑組（EA+vehicle組），其中MCAO組、EA+MCAO組處理方法如前所述；EA+AM251組、EA+vehicle組:分別給予AM251（1mg/kg）和溶劑腹腔注射30min后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，持續(xù)電針30min，電針后2h進(jìn)行MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌。EA+SR141716組：麻醉后，持續(xù)電針30min，電針后2h進(jìn)行MCAO模型，模型后30min給予SR141716（1mg/kg），缺血1h后再灌。所有小鼠缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。 2. CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2對(duì)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)的影響 將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組：模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）、ACEA預(yù)處理組（MCAO+ACEA組）、WIN55,212-2預(yù)處理組（MCAO+WIN組）、溶劑組（MCAO+vehicle組），其中MCAO組、EA+MCAO組、處理方法如前所述；MCAO+ACEA組、MCAO+WIN組、MCAO+vehicle組:分別給予ACEA（2.5mg/kg）、WIN55,212-2（1.5mg/kg）和溶劑腹腔注射30min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，進(jìn)行MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌。缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。 3.電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影響 將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組：假手術(shù)組（sham組）、單純電針組（EA組）、模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組），其處理方法如前所述。缺血再灌注2h后取材，進(jìn)行western-blot觀察STAT3磷酸化水平變化情況。 4. CB1受體抑制劑AM251、SR141716對(duì)電針預(yù)處理后pSTAT3水平的影響 將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組：模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）、AM251預(yù)處理組（EA+AM251組）、SR141716預(yù)處理組（EA+SR141716組）、溶劑組（EA+vehicle組），其處理如前所述。缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。 5. CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2對(duì)小鼠腦缺血再灌注后pSTAT3水平的影響 將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組：模型組（MCAO組）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組）、ACEA預(yù)處理組（MCAO+ACEA組）、WIN55,212-2預(yù)處理組（MCAO+WIN組）、溶劑組（MCAO+vehicle組），其處理方法如前所述。缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。 結(jié)果 1. CB1受體抑制劑AM251、SR141716可下調(diào)電針預(yù)處理后SOD2的表達(dá) 給予CB1受體抑制劑AM251、SR141716后，western-blot結(jié)果顯示與MCAO組相比，EA+MCAO組SOD2表達(dá)均明顯增加（P0.05）；與EA+MCAO組相比，EA+AM251組和EA+SR141716組SOD2表達(dá)均明顯降低（P0.05）。 2. CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2可上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后SOD2的表達(dá) 給予CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2后，western-blot結(jié)果顯示與MCAO組相比，MCAO+ACEA組、MCAO+WIN組SOD2表達(dá)明顯增加（P0.05）。 3.電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影響 缺血再灌注2h后，與sham組相比，EA組pSTAT3水平無(wú)明顯變化，而MCAO組pSTAT3表達(dá)明顯下降（P0.05）；與MCAO組相比， EA+MCAO組pSTAT3表達(dá)明顯升高（P0.05）。 4. CB1受體抑制劑AM251、SR141716可降低電針預(yù)處理后pSTAT3水平 給予CB1受體抑制劑AM251、SR141716后，結(jié)果顯示與MCAO組相比，EA+MCAO組pSTAT3水平均明顯升高（P0.05）；與EA+MCAO組相比，EA+AM251組和EA+SR141716組pSTAT3水平均明顯降低（P0.05）。 5. CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2可升高小鼠腦缺血再灌注后pSTAT3水平 給予CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2后，結(jié)果顯示與MCAO組相比，MCAO+ACEA組、MCAO+WIN組pSTAT3水平明顯升高（P0.05）。 結(jié)論 電針預(yù)處理通過(guò)CB1受體促進(jìn)STAT3磷酸化水平，從而上調(diào)SOD2表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)采用雄性C57BL/6小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，首先通過(guò)western-blot和免疫熒光結(jié)果證實(shí)了電針預(yù)處理上調(diào)小鼠缺血再灌注2h后神經(jīng)元SOD2表達(dá)。隨后側(cè)腦室注射給予SOD2-siRNA，發(fā)現(xiàn)SOD2-siRNA可以逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化作用以及腦保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)電針預(yù)處理激活SOD2減輕氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)腦缺血耐受。那么，電針預(yù)處理上調(diào)SOD2表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制又是什么？針對(duì)這一問(wèn)題，接下來(lái)實(shí)驗(yàn)給予CB1受體的抑制劑和激動(dòng)劑，證實(shí)電針預(yù)處理通過(guò)CB1受體促進(jìn)STAT3磷酸化水平，從而上調(diào)SOD2表達(dá)�？傊�，本研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理通過(guò)CB1受體促進(jìn)STAT3磷酸化，上調(diào)腦缺血后SOD2表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制缺血后神經(jīng)元凋亡從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。這一研究結(jié)果不僅為揭示電針預(yù)處理腦保護(hù)措施分子機(jī)制做出貢獻(xiàn)，也為其臨床應(yīng)用推廣提供更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R246.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉智斌;牛文民;;“嗅三針”電刺激對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元線(xiàn)粒體保護(hù)作用的觀察[J];針刺研究;2007年03期

本文編號(hào)：1767315