發(fā)布時間：2018-04-13 10:39

  本文選題：腎間質(zhì)纖維化 + 氣虛血瘀證��； 參考：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的： 腎間質(zhì)纖維化是決定慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的重要因素,早期防治甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對防治CKD的發(fā)展具有重要的意義。診斷腎臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)為腎穿刺病理活檢,但它需要取出一小部分腎組織來進(jìn)行病理檢驗,是一項侵入性的操作,存在3%的主要并發(fā)癥如出血、組織損傷等風(fēng)險,所以尋找可靠、無創(chuàng)傷的生物標(biāo)志物具有重要的意義。 MicroRNAs(miRNAs)在腎臟疾病診斷及判斷疾病的進(jìn)展中具有重要作用,miRNAs在組織和體液中都非常的穩(wěn)定,收集尿液的操作簡易可行,所以識別尿液miRNAs水平可作為一種的判斷疾病的具有潛在的吸引力的生物標(biāo)志物。miR-21是腎臟纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié),持續(xù)地過表達(dá)miR-21擾亂了組織的修復(fù)并且導(dǎo)致組織纖維化,研究報道在腎臟纖維化的經(jīng)典動物模型單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)中,miR-21的表達(dá)水平增強(qiáng),抑制miR-21的表達(dá)后大鼠模型的腎臟纖維化程度明顯改善。抑制miR-21是改善組織纖維化的一條新途徑。 近年來現(xiàn)代化的中醫(yī)藥研究迫切需要具有中醫(yī)證候特點(diǎn)或“病證結(jié)合”的生物標(biāo)志物和動物模型,以便使中醫(yī)藥科研工作更加科學(xué)化、客觀化,這是目前中西醫(yī)學(xué)者研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。文獻(xiàn)報道,氣虛血瘀證為腎間質(zhì)纖維化患者的最常見的中醫(yī)證候,本臨床研究擬用定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-qPCR)測定腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證患者腎活檢當(dāng)日尿沉渣中的miR-21mRNA的表達(dá),并且探討其與腎間質(zhì)纖維化程度、氣虛血瘀證積分等指標(biāo)之間的相關(guān)性。 既往研究提示三芪口服液(廣東省中醫(yī)院院內(nèi)制劑,由黃芪、三七等組成)可有效防治單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型的腎間質(zhì)纖維化,但具體作用機(jī)制有待深入研究。本研究我們通過單側(cè)輸尿管梗阻模型(UUO)加大鼠疲勞力竭游泳的方法建立病證結(jié)合的模型(腎間質(zhì)纖維化加氣虛血瘀證模型),檢測三芪口服液干預(yù)后腎組織miR-21mRNA以及基因芯片檢測差異基因的表達(dá),進(jìn)一步RT-qPCR法驗證,以期闡釋三芪口服液防治UUO模型氣虛血瘀證大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。 綜上所述,本研究針對腎間質(zhì)纖維化的miR-21mRNA表達(dá)進(jìn)行了探討,臨床部分旨在檢測腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證患者尿沉渣miR-21mRNA表達(dá)及探討與纖維化程度等之間的相關(guān)性,以期探索出無創(chuàng)的生物標(biāo)志物為本病提供預(yù)測依據(jù)；實驗部分旨在構(gòu)建腎間質(zhì)纖維化加氣虛血瘀證模型基礎(chǔ)上,檢測三芪口服液干預(yù)后腎組織miR-21mRNA以及基因芯片檢測差異基因的表達(dá),以期闡釋三芪口服液防治UUO模型氣虛血瘀證大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。 方法： 1臨床研究 1.1病例選擇 選擇符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)(符合慢性腎臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)及氣虛血瘀證的辨證標(biāo)準(zhǔn)等)及除外排除標(biāo)準(zhǔn)的患者共30例。 1.2研究分組 入院行腎活檢術(shù)后,根據(jù)腎臟病理提示有無存在腎間質(zhì)纖維化而分為纖維化組和無纖維化組兩組。纖維化組即腎臟病理提示存在腎間質(zhì)纖維化的患者共20例,無腎間質(zhì)纖維化的患者共10例；另選擇健康對照組共10例。 1.3檢測指標(biāo)及研究內(nèi)容 檢測兩組患者腎活檢前24h尿蛋白定量、血紅蛋白、血清白蛋白、血清肌酐,計算腎小球濾過率(eGFR)及計算氣虛血瘀證的積分；留取患者腎活檢當(dāng)日及健康組的晨尿,應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-qPCR)檢測各組尿沉渣miR-21mRNA的表達(dá),比較各組間尿沉渣miR-21mRNA的表達(dá)差異,并探討其與腎間質(zhì)纖維化、氣虛血瘀證等指標(biāo)之間的相關(guān)性。 2實驗研究 2.1研究分組 24只SD大鼠隨機(jī)分為三組：空白組、纖維化氣虛血瘀證模型組(以下簡稱模型組)、纖維化氣虛血瘀證+三芪口服液組(以下簡稱三芪組),每組均8只。 2.2造模方法 2.2.1UUO模型復(fù)制方法 UUO模型復(fù)制采用左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù),術(shù)前器械消毒,大鼠稱重后用10%水合氯醛0.3-0.4ml/100g腹腔內(nèi)注射麻醉,將大鼠俯臥位固定于鼠板,備皮,常規(guī)消毒,戴無菌手套,鋪無菌孔巾,在大鼠背部,左側(cè)肋腰點(diǎn)下約0.5cm、脊柱左側(cè)約1cm作一縱向切口,1.5-2cm長,逐層分離皮下組織、肌肉,充分暴露腎臟,用小彎鑷輕輕剝離腎下極部分包膜及腎蒂處包膜,分離出輸尿管,用“1”號絲線分別在緊靠腎盂處及遠(yuǎn)離腎孟約lcm處結(jié)扎輸尿管,在兩結(jié)點(diǎn)中間離斷輸尿管,用慶大霉素生理鹽水沖洗腹腔后,檢查無滲漏和出血后逐層縫合肌肉及背部常規(guī)消毒。 2.2.2氣虛血瘀證模型復(fù)制方法 采用大鼠疲勞力竭游泳的方法復(fù)制氣虛血瘀證中醫(yī)證候模型,模型復(fù)制時間為28天。游泳條件為：(1)室溫：24-25℃；(2)游泳水溫：22～24℃；(3)游泳場地：為直徑50cm,高度60cm的圓形水槽,水深控制為45-50cm；(4)力竭標(biāo)準(zhǔn)：以大鼠冗入水中10s不能自行浮出水面為力竭,即將大鼠撈出。當(dāng)全組50%自然沉降時停止 2.2.3纖維化氣虛血瘀證模型復(fù)制的方法 根據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)及前期實驗研究結(jié)果,采用UUO模型加大鼠疲勞力竭游泳實驗的方去復(fù)制：在UUO模型復(fù)制10天,大鼠傷口完全愈合后開始疲勞力竭游泳,連續(xù)28天進(jìn)行模型復(fù)制。 2.3干預(yù)措施 三芪組的干預(yù)開始時間與氣虛血瘀證模型復(fù)制時間同步,上午進(jìn)行模型復(fù)制,下午進(jìn)行給藥干預(yù)。三芪口服液組按照成人每日藥劑量核算大鼠的每日藥劑量,每日大鼠的給藥劑量為1.2m1/100g大鼠,其余各組予以等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)給藥28天。 2.4檢測指標(biāo) 2.4.1檢測各組大鼠腎組織HE、Masson染色及AFS、CIS的病理積分、氣虛血瘀證積分的變化。 2.4.2基因芯片檢測：具體步驟為,腎組織總RNA的進(jìn)一步純化、鑒定及標(biāo)記；RNA的鑒定；采用安捷倫大鼠全基因表達(dá)譜芯片(每個芯片含41000個基因探針),每份標(biāo)記的RNA標(biāo)本分別單獨(dú)與一個基因芯片進(jìn)行雜交(每個時間點(diǎn)實驗組、對照組各5個標(biāo)本)。統(tǒng)計學(xué)分析方法：掃描結(jié)果使用數(shù)據(jù)處理軟件安捷倫芯片數(shù)據(jù)提取軟件10.5.1.1進(jìn)行處理；差異基因分析與信號通路分析則是將實驗組與對照組進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗,以P0.05、基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)≥2為標(biāo)準(zhǔn),差異有顯著性的即為與纖維化信號通路相關(guān)的基因。信號通路分析以Fisher's精確性檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2.4.3定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-qPCR)檢測各組miR-21mRNA及差異基因以及的表達(dá),探索三芪口服液防治腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證模型大鼠的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1臨床研究 1.1納入研究者一般情況 符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的慢性腎臟病患者30例,其中男性16例,女性14例。另選取健康組10例,其中男性6人,女性4人。慢性腎臟病組同健康組在性別、年齡方面比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義； 1.2患者原發(fā)病構(gòu)成 入院后腎穿刺病理活檢提示,IgA腎病患者24例,局灶增生腎小球硬化3例,慢性間質(zhì)性腎炎3例；其中存在腎間質(zhì)纖維化的患者20例,無腎間質(zhì)纖維化患者10例。將腎臟活檢病理提示存在腎間質(zhì)纖維化的20例患者納入纖維化組,無腎間質(zhì)纖維化患者的10例納入無纖維化組； 1.3生化指標(biāo)、氣虛血瘀證積分及腎間質(zhì)纖維化程度 纖維化組和無纖維化組比較,氣虛血瘀證積分明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),兩組在年齡、血紅蛋白、血白蛋白、24h尿蛋白定量、血清肌酐、eGFR等方面比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義； 1.4尿沉渣miR-21mRNA表達(dá)水平 纖維化組分別與無纖維化組患者及健康組比較,尿miR-21mRNA表達(dá)水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P0.05,P0.01)；無纖維化組患者與健康組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義； 1.5相關(guān)性研究 腎間質(zhì)纖維化程度與尿沉渣miR-21mRNA水平、氣虛血瘀證積分均呈正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.573,p=0.001；r=0.531,p=0.003)；與eGFR呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.620,p=0.000)；尿沉渣miR-21mRNA水平與腎間質(zhì)纖維化程度、氣虛血瘀證積分均呈正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.573,p=0.001；r=0.619,p=0.000)。 2實驗研究 2.1一般情況 實驗過程中,模型組及三芪組各老鼠死亡1只,原因為游泳疲勞實驗過程中溺死,空白對照組大鼠體重增長明顯,精神狀況良好,動作自如,反應(yīng)靈敏,毛皮有光澤；模型組大鼠明顯消瘦,飲水較多,小便多,大便溏,精神萎靡,反映遲鈍,毛豎無光澤,動作遲緩。三芪組大鼠精神狀況較差,動作稍遲緩,體形較模型組組增長,大便成形,小便較多,對外界反映靈敏度較正常組差優(yōu)于模型組。 2.2氣虛、血瘀證積分 模型組大鼠氣虛證、血瘀證積分均明顯升高,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P0.05,P0.01),提示模型組成功構(gòu)建了氣虛血瘀證的模型。三芪組大鼠氣虛證、血瘀證積分均明顯減少,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而與空白組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示益氣活血功效的三芪口服液可以明顯改善模型大鼠的氣虛血瘀證。 2.3HE及Masson染色、腎小管間質(zhì)細(xì)胞浸潤評分(CIS)及腎間質(zhì)慢性病變積分(AFS) HE、Masson染色可見,模型組、三芪組出現(xiàn)明顯腎小管間質(zhì)纖維化,CIS、AFS評分明顯增高,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001),提示腎間質(zhì)纖維化模型構(gòu)建成功；三芪組與模型組比較,模型大鼠的腎間質(zhì)纖維化明顯改善,CIS、AFS評分明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.4基因芯片結(jié)果 2.4.1信號通路分析 模型組與空白組比較,共42個信號通路出現(xiàn)上調(diào),并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中與纖維化相關(guān)的MAPK信號通路的Fisher-Pvalue為0.0058；三芪組與模型組比較,共30個信號通路出現(xiàn)下調(diào),并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中MAPK信號通路的P值為0.013。 2.4.2差異基因分析 模型組與空白組比較,MAPK信號通路中p38/MAPK多個基因上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),尤其是促炎癥因子,如TNF、IL-1、FASL、TGF-β的表達(dá)上調(diào)；三芪組與模型組比較,MAPK信號通路中ERK/MAPK以及p38/MAPK中多個基因出現(xiàn)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),尤其是促炎癥因子,如TNF、IL-1、FASL等的表達(dá)下調(diào)。 2.5RT-qPCR檢測miR-21、TNF-α］IL-1、Smad7、α-SMA mRNA 文獻(xiàn)報道m(xù)iR-21、Smad7是改善腎纖維化的新途徑。α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白�；蛐酒Y(jié)果提示模型組多個促炎癥因子(TNF、IL-1)過表達(dá),三芪口服液可以明顯下調(diào)以上因子的表達(dá),所以本研究通過檢測miR-21、Smad7、TNF-α、IL-1及α-SMAmRNA表達(dá),探索三芪口服液防治腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)一步機(jī)制。 結(jié)果提示,模型組miR-21、IL-1、α-SMA mRNA表達(dá)均明顯上調(diào),與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別是P0.01,P0.05)；與模型組比較,三芪組miR-21、IL-1、 α-SMA mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；三芪組Smad7mRNA表達(dá)明顯升高,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；但模型組與空白組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；三組TNF-α mRNA的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1臨床研究 1.1腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證患者尿沉渣miR-21mRNA的表達(dá)水平明顯高于健康組及無纖維化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P0.05,P0.01)；無腎間質(zhì)纖維化的患者與健康組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 1.2尿沉渣miR-21mRNA水平與腎間質(zhì)纖維化程度、氣虛血瘀證積分均呈正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.573, p=0.001; r=0.619, p=0.000)。 以上結(jié)果提示,尿沉渣miR-21mRNA可能為腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證患者的特異性指標(biāo)之一,在今后的工作中值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入研究。 2實驗研究 2.1單側(cè)輸尿管梗阻模型(UUO)加疲勞力竭游泳實驗造模,病理結(jié)果提示模型組腎小管間質(zhì)纖維化明顯,氣虛血瘀證積分明顯升高,腎組織miR-21mRNA表達(dá)明顯上調(diào),提示成功地復(fù)制出“腎間質(zhì)纖維化+氣虛血瘀證”的“病證結(jié)合”的動物模型。 2.2三芪口服液能有效改善UUO氣虛血瘀證大鼠的腎間質(zhì)纖維化,其機(jī)制可能是通過下調(diào)miR-21、IL-1、α-SMAmRNA的表達(dá),上調(diào)Smad7mRNA的水平,改善炎癥狀態(tài)、減少成纖維化細(xì)胞的增殖,從而改善腎間質(zhì)纖維化。 綜上所述,本研究從臨床及實驗研究兩部分針對腎間質(zhì)纖維化的miR-21表達(dá)進(jìn)行了研究,為腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證患者提供了可靠、無創(chuàng)傷的臨床預(yù)測因子,以及闡釋了三芪口服液有效防治腎間質(zhì)纖維化氣虛血瘀證的機(jī)制,為進(jìn)一步新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R277.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1744138