本文選題：瞬時感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型 + 神經再生�。� 參考：《南京醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景成年哺乳動物腦內的神經再生(adult neurogenesis)對于維持腦的正常功能具有重要意義。神經再生過程主要包括干細胞的增殖、前體細胞的存活和分化、新生神經元的成熟、突觸形成和神經回路整合等幾個階段。鈣離子(calcium,Ca2+)作為細胞內重要的第二信使,在細胞的增殖、發(fā)育、遷移和存活等多個過程中起重要調節(jié)作用。瞬時感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬時感受器電位(transient receptor potential,TRP)受體家族成員之一。TRPV4受體廣泛分布在中樞神經系統(tǒng)的海馬、大腦皮層、丘腦和小腦等腦區(qū)。TRPV4受體是一種對Ca2+具有選擇通透性的陽離子通道,激活TRPV4受體可引起胞內游離鈣離子水平(intracellular free Ca2+concentration,[Ca2+]i)升高。TRPV4受體激活后可通過其介導的Ca2+內流促進豬內皮細胞、食管內皮細胞和人腦毛細血管內皮細胞的增殖。此外,[Ca2+]i水平對神經元的突起生長起重要調節(jié)作用,[Ca2+]i過高或過低都能顯著抑制神經元的軸突延伸和樹突發(fā)育。TRPV4受體功能獲得性基因突變所致的[Ca2+]i升高在周圍運動神經元軸突病變過程中起著重要的作用。然而,目前尚無有關TRPV4受體調控成年海馬神經再生的相關報道。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號通路在細胞的增殖、分化、遷移和存活等過程中起重要調控作用。在肺內皮細胞、三叉神經節(jié)、背根神經節(jié)感覺神經元、毛細血管內皮細胞、脂肪細胞以及海馬神經元上的研究發(fā)現(xiàn),TRPV4受體激活后能夠上調細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和 p38 MAPK 信號通路。AMP 激活的蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,AMPK激活后通過作用于下游一系列與突起生長有關的信號通路,導致細胞骨架降解,抑制神經突起生長。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通過調節(jié)其下游的信號分子如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β,GSK3β)的活性在神經元突起生長過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),急性激活TRPV4受體可通過其介導的鈣離子內流影響AMPK-Akt信號通路的活性。基于上述報道和前期研究,本課題提出激活TRPV4受體可能通過MAPK或AMPK-Akt信號通路調節(jié)成年海馬齒回神經干細胞增殖和新生神經元突起生長,為調控成年海馬神經再生提供新靶點。研究目的1.明確激活TRPV4受體對海馬齒回神經干細胞增殖的作用及其機制。2.明確激活TRPV4受體對海馬齒回新生神經元突起生長的作用及其機制。第一部分 激活TRPV4受體對成年海馬齒回神經干細胞增殖的作用及其分子機制材料與方法1.制備TRPV4受體激活的在體模型:側腦室注射不同劑量的TRPV4受體激動劑GSK1016790A,制備TRPV4受體激活的在體模型。2.免疫組織化學染色:5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)用PBS溶解后按照每只小鼠50 mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射3次,間隔8 h,標記有絲分裂的細胞。小鼠用水合氯醛腹腔麻醉(400 mg/kg)后,先后用PBS和4%多聚甲醛進行心臟灌流固定,取腦組織后于4%多聚甲醛固定液(4℃)中固定48 h。選擇海馬部位,用振動切片機進行冠狀連續(xù)切片,進行BrdU和Ki67免疫組織化學染色,檢測激活TRPV4受體對神經干細胞增殖的作用。3.蛋白印跡(Western blot):檢測GSK1016790A對海馬組織目標蛋白的作用。結果1.給予GSK1016790A能增加海馬齒回SGZ區(qū)1天齡BrdU陽性細胞(1-day-old BrdU positive,1-day-old BrdU+)和 Ki67 陽性細胞(Ki67 positive,Ki67+)數(shù)目,增加增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的蛋白水平。2.給予GSK1016790A能顯著增加海馬組織周期素依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)和 CDK6,周期素 El(cyclinEl)和 cyclinA2,以及磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(phosphorylated retinoblastoma protein,p-Rb)的蛋白水平,但對CDK4和cyclinDl蛋白水平無顯著影響。3.給予GSK1016790A能顯著增加海馬組織磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERKl/2)和磷酸化 p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。4.絲裂素活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)的抑制劑U0126或p38 MAPK特異性抑制劑SB203580能顯著降低GSK1016790A注射組小鼠1-day-old BrdU+和Ki67+細胞數(shù)目及PCNA蛋白水平。給予U0126或SB203580能明顯降低GSK1016790A注射組小鼠CDK2和 CDK6,cyclin E1 和 cyclin A2,以及 p-Rb 蛋白水平。結論激活TRPV4受體可通過增強ERK和p38 MAPK信號通路增加細胞周期相關蛋白CDK2、CDK6和cyclinEl、cyclinA2表達,提高Rb的磷酸化水平,加速細胞周期進程,促進成年海馬齒回神經干細胞增殖。第二部分激活TRPV4受體對成年小鼠海馬齒回新生神經元突起生長的作用及分子機制材料與方法1.制備TRPV4受體激活的在體模型:側腦室注射不同濃度劑量的TRPV4受體激動劑GSK1016790A,制備激活TRPV4受體的在體模型。2.免疫組織化學染色:小鼠用水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg)后,先后用PBS和4%多聚甲醛進行心臟灌流固定,取腦組織后于4%多聚甲醛固定液(4℃)中后固定48 h。選擇海馬部位,用振動切片機進行冠狀連續(xù)切片,進行雙皮質素(doublecortin,DCX)免疫組織化學染色,檢測激活TRPV4受體對新生神經元突起生長的作用。3.蛋白印跡(Western blot):檢測GSK1016790A對海馬組織目標蛋白表達的作用。結果1.側腦室注射GSK1016790A能顯著降低成年小鼠海馬齒回DCX陽性細胞(doublecortin positive,DCX+)及突起數(shù)目。2.給予 GSK1016790A 30 min 至 2 h 磷酸化 AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)的蛋白水平顯著增加;給予GSK1016790A 1 d至5 d p-AMPK蛋白水平顯著降低;給予GSK1016790A 30min至5d磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)的蛋白水平顯著降低。給予AMPK抑制劑compound C能明顯阻斷GSK1016790A降低p-Akt蛋白水平的作用,而給予AMPK激動劑AICAR則無此作用。3.給予 GSK1016790A 能夠明顯降低磷酸化 mTOR(phosphorylaed mTOR,p-mTOR)和磷酸化 70kDa 核糖體蛋白 S6 激酶(phosphorylaed p70 ribosomal S6 kinase,p-p70S6K)的蛋白水平;給予磷酸肌醇3激酶的激動劑740 Y-P或compound C能有效阻斷GSK1016790A的上述作用。給予GSK1016790A能夠顯著增加磷酸化 GSK3β(Y216)位點(phosphorylatedGSK3βatY216,p-GSK3βY216)的蛋白水平、磷酸化微管相關蛋白2(phosphorylated microtubule-associated protein 2,p-MAP2)和磷酸化坍塌反應調節(jié)蛋白 2(phosphorylation of collapsin response mediator protein-2,p-CRMP-2)的水平;給予740 Y-P或compound C能有效阻斷GSK1016790A增加p-GSK3βY216、p-MAP2 和 p-CRMP-2 蛋白水平的作用。4.給予compound C或740 Y-P能顯著增加GSK1016790A注射組小鼠海馬齒回DCX+細胞及神經突起的數(shù)目,而給予AICAR對GSK1016790A減少DCX+細胞及神經突起數(shù)目的作用無影響。結論激活TRPV4受體通過增強AMPK的活性下調Akt信號通路,進而抑制mTOR-p70S6K信號通路、激活GSK3β抑制MAP2和CRMP-2的功能,最終抑制新生神經元的突起生長。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q42

【參考文獻】

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1 Fei Ren;Hong Zhang;Chao Qi;Mei-ling Gao;Hong Wang;Xia-qing Li;;Blockade of transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 promotes regeneration after sciatic nerve injury[J];Neural Regeneration Research;2015年08期

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本文編號：1739955