本文選題：原發(fā)性肝癌 + A12R��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 原發(fā)性肝癌(HCC)是我國常見惡性腫瘤之一,死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位列第3。我國每年死于肝癌約11萬人,占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。一旦被診斷為晚期肝癌,無論是對患者本身還是家庭都是具有災(zāi)難性的,而對于這些晚期的肝癌患者,常規(guī)療法已不再起作用。此外,腫瘤細(xì)胞中高效的藥物代謝和具耐藥性的運(yùn)輸?shù)鞍椎拇嬖?也進(jìn)一步降低了治療肝癌的療效。因此,我們需要更改治療方案來克服這些障礙,從而提高治療效果。 血管緊張素II(Ang II),通過兩個明確的受體：AngII1型(AT1R)和2型受體(AT2R),在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近的研究表明Ang II信號在腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用。使用小鼠肝癌的模型,Yoshiji和同事發(fā)現(xiàn)基于一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑(培哚普利[PE])的聯(lián)合治療能夠抑制由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)過表達(dá)引起的血管生成.AT2R在多種細(xì)胞系中發(fā)揮著抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,如血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,前列腺癌和肺癌細(xì)胞,但AT2R對HCC的作用目前還不清楚。 本研究的目的是探索AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞和人原發(fā)性肝癌的裸鼠模型的影響。將AT2R重組腺病毒載體(Ad-G-AT2R-EGFP)感染肝癌細(xì)胞株及原位腫瘤,以檢測其對肝癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明高劑量Ad-G-AT2R-EGFP誘導(dǎo)的AT2R過表達(dá)促使肝癌細(xì)胞凋亡。AT2R在SMMC7721細(xì)胞的過表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖,使S期細(xì)胞顯著減少,并通過改變CD4和cyclinD1的表達(dá)使G1期細(xì)胞增多。數(shù)據(jù)還表明,過表達(dá)的AT2R是通過細(xì)胞死亡信號通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的,這條通路依賴激活人的p38MAPK,JNK,caspase-3同時使pp42/44MAPK(Erkl/2)失活來產(chǎn)生作用。最后,我們證明了適度增加AT2R表達(dá)可能會增加HCC腫瘤的生長和肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖。我們的研究結(jié)果表明AT2R過表達(dá)控制著肝癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖,而AT2R對肝癌細(xì)胞生長的影響可能與的表達(dá)水平有關(guān),但是這一現(xiàn)象的明確機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。 本課題以人肝癌細(xì)胞為主要研究對象,從以下幾個方面展開研究： 一.AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞的影響 目的：明確肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性AT2R的表達(dá)情況以及AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞的影響。 方法：Real-time PCR從基因水平檢測肝癌細(xì)胞AT2R的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,WST-1細(xì)胞增殖試驗,TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡,檢測腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞生長增殖以及凋亡的影響。 結(jié)論：1.檢測細(xì)胞內(nèi)源性AT2R的表達(dá)情況 使用Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞SMMC7721、Be17402、HepG2中內(nèi)源性AT2R的表達(dá)情況,Real-time PCR結(jié)果Ct值大于33.0,結(jié)果提示肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性AT2R表達(dá)量較低,基本檢測不到。 2.AT2R重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞效果的驗證 (1)AT2R重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效果 本研究中使用的AT2R重組腺病毒載體Ad-G-AT2R-EGFP及對照載體Ad-EGFP,兩個載體均為在CMV啟動子控制下的5型腺病毒,已被證明能在多種細(xì)胞或組織中介導(dǎo)外源基因高效表達(dá),對肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402以及正常肝細(xì)胞系L02的感染效率均可達(dá)到95%以上。病毒載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel7402以及正常肝細(xì)胞LO236hrs后,熒光顯微鏡觀察,SMMC7721和Bel7402細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,開始出現(xiàn)類似凋亡的現(xiàn)象(Fig.l)。 (2)不同劑量病毒感染肝癌細(xì)胞AT2RmRNA的表達(dá)情況 使用1-500ifu/cell劑量的AT2R重組腺病毒感染肝癌細(xì)胞SMMC7721,24hrs后real-time PCR檢測AT2R mRNA表達(dá)情況。SMMC7721內(nèi)源性AT2RmRNA基本檢測不到,以感染1ifu/cell劑量的SMMC7721細(xì)胞中AT2RmRNA表達(dá)量作為參照,轉(zhuǎn)染不同劑量AT2R重組腺病毒(1-500ifu/cell)的肝癌細(xì)胞SMMC7721中AT2RmRNA相對表達(dá)情況呈倍數(shù)增長(Fig.2),證明AT2R的表達(dá)量隨著加入的腺病毒量增加而增加。 3.腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞周期和生長的影響 AT2R重組腺病毒載體及對照載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721和正常肝細(xì)胞LO224hrs后,70%乙醇固定細(xì)胞,RNase A處理細(xì)胞,PI染色,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果表明AT2R過表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC7721的生長增殖,使細(xì)胞停留在G1期(Fig.3A),而對正常肝細(xì)胞L02無明顯影響(Fig.3B,C)。分別用AT2R及對照的腺病毒載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721,加入WST-1作用2hrs后,酶標(biāo)儀檢測OD450。連續(xù)測定6天,繪制曲線,發(fā)現(xiàn)AT2R過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖(p0.01)(Fig.4A),同時Western-Blot檢測結(jié)果表明與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白CDK4和cyclin D1表達(dá)下調(diào)(Fig.4B),結(jié)果初步提示AT2R過表達(dá)可通過CDK4和cyclin D1表達(dá)變化阻滯細(xì)胞停留在G1期,從而抑制肝癌細(xì)胞的生長和增殖。 4.腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響 AT2R重組腺病毒載體及對照載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721和Bel740248hrs后,多聚甲醛固定細(xì)胞,進(jìn)行TUNEL染色,觀察凋亡效果(Fig.5)。結(jié)果提示AT2R重組腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721和Be17402發(fā)生凋亡。 結(jié)果表明,從基因水平檢測得出肝癌細(xì)胞SMMC7721中AT2R的表達(dá)很低,幾乎可以忽略；另外我們通過AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞生長、增殖以及細(xì)胞凋亡的影響研究發(fā)現(xiàn)由腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長增殖,使細(xì)胞停留在G1期,并且導(dǎo)致肝癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象,而對正常肝細(xì)胞未有顯著影響。 二.AT2R過表達(dá)對肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的分子機(jī)制 目的：確定肝癌細(xì)胞中與過表達(dá)的AT2R最直接的相互作用蛋白,確定AT2R對肝癌細(xì)胞的促凋亡作用的信號通路和調(diào)節(jié)機(jī)制,尋找相互作用蛋白與凋亡相關(guān)信號通路之間的關(guān)鍵分子,建立其與誘導(dǎo)凋亡的信號通路之間的聯(lián)系。 方法：分別用AT2R及對照的腺病毒載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721,檢測細(xì)胞生長增殖情況,繪制細(xì)胞生長曲線,TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況,Western-Blot檢測MAPK家族相關(guān)激酶(p38MAPK,Erk或JNK)通路上游關(guān)鍵分子的表達(dá)情況。在AT2R及其對照的腺病毒載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721前后,Western Blot分析相關(guān)激酶的磷酸化水平和蛋白質(zhì)水平,細(xì)胞內(nèi)Caspase-3,Caspase-8活性檢測。 結(jié)論：1.相關(guān)激酶活性檢測 AT2R重組腺病毒載體及對照載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721,經(jīng)36hrs后收集細(xì)胞,Western-Blot檢測p38、p42/p44MAPK(Erkl/2)、JNK及其相應(yīng)磷酸化的pp38、pp42/p44MAPK(pErk1/2)、pJNK/JNK的表達(dá)情況(Fig.9)。與對照相比,AT2R過表達(dá)的肝癌細(xì)胞SMMC7721中pp38/p38的比例有所提高,pp42/p44MAPK(pErk1/2)下調(diào),pJNK/JNK與對照組相比表達(dá)增高,初步提示AT2R過表達(dá)對細(xì)胞產(chǎn)生的影響可能是通過激活p38和JNK同時抑制p42/p44MAPK(Erk1/2)的激活來實現(xiàn)的。 2.確定AT2R對肝癌細(xì)胞的促凋亡作用的信號通路和調(diào)節(jié)機(jī)制 不同濃度AT2R重組腺病毒載體及對照載體感染肝癌細(xì)胞SMMC7721,36hrs后收集細(xì)胞,使用Caspase-3和cleaved Caspase-3抗體western blot檢測細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-8的激活情況,同時使用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測其活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡過程中有caspase-3和Caspase-8的激活。 三.腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)對肝癌原位移植瘤裸鼠模型的影響 目的：建立可活體觀察的肝癌原位移植瘤裸鼠模型。構(gòu)建AT2R及對照的腺病毒表達(dá)載體,全面評估由腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)對腫瘤生長的影響。 方法：建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光素酶的肝癌細(xì)胞株,取4-5周齡裸鼠,手術(shù)開腹暴露肝臟,將穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光素酶的肝癌細(xì)胞SMMC7721細(xì)胞懸液肝臟原位注射,制作肝癌裸鼠移植瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分組.三天后尾靜脈注射0.1m1腺病毒載體Ad-G-AT2R-EGFP、Ad-G-EGFP或PBS,病毒量為1×109感染單位/(只·次)],1次/2天,共3次。經(jīng)裸鼠腹腔注射熒光素酶底物D-Luciferin Ksalt,麻醉固定裸鼠,Xenogen IVIS-200小動物熒光活體成像儀動態(tài)監(jiān)控裸鼠中腫瘤生長情況。注射病毒一個月后,利用熒光活體成像儀圖像動態(tài)監(jiān)控裸鼠中腫瘤生長情況進(jìn)行分析定量評估。腺病毒靶器官感染效果的評價,Real-time PCR檢測靶器官AT2R基因的表達(dá)水平。觀察裸鼠存活期,病理學(xué)觀察、及癌細(xì)胞增殖抗原(Ki67)檢測。 結(jié)論：1.建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光素酶的肝癌細(xì)胞 構(gòu)建含熒光素酶的慢病毒載體pTYF-CMV-LUC-2A-RFP系統(tǒng),并轉(zhuǎn)導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721,加入底物D-Luciferin K salt反應(yīng)后,Xenogen IVIS-200小動物熒光活體成像儀觀察熒光,結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的肝癌細(xì)胞株成功建立(Fig.7)。 2.建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光素酶的肝癌移植瘤裸鼠模型 表達(dá)熒光素酶的肝癌細(xì)胞SMMC7721原位注射BALB/c裸鼠肝臟,建立裸鼠肝癌模型,Xenogen IVIS-200小動物熒光活體成像儀觀察裸鼠中肝癌的生長情況(Fig.8A)。 3.腺病毒介導(dǎo)的AT2R過表達(dá)對肝癌原位注射瘤生長的影響。 肝癌細(xì)胞原位注射三周后,裸鼠尾靜脈注射AT2R腺病毒載體及其對照病毒載體,一個月后熒光活體成像儀觀察裸鼠中肝癌生長情況,處死裸鼠取肝臟腫瘤組織,計算體積并稱重。Real-time PCR檢測不同實驗組和對照組肝臟腫瘤組織中AT2R mRNA表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT2R重組腺病毒實驗組肝組織腫瘤體積與病毒對照組及PBS對照組有明顯差異,檢測實驗組相應(yīng)肝臟腫瘤組織中AT2R mRNA表達(dá)量僅不足10ifu/cell(Fig.8D)。AT2R mRNA的表達(dá)在Ad-CMV-EGFP或PBS組中幾乎檢測不到。隨后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析Ki67在腫瘤組織表達(dá)。如Fig.8所示,用Ad-G-AT2R-EGFP治療的小鼠SMMC7721細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng),這與用高劑量Ad-G-AT2R-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)處理的SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)模型所觀察到的結(jié)果相反(P0.05)。 綜上所述,高水平表達(dá)的AT2R可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖,適度增加體內(nèi)AT2R表達(dá)實際上可能促進(jìn)肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖和腫瘤生長。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 李妍;杜紅延;李紅衛(wèi);;慢病毒載體及其在RNA干擾技術(shù)中的應(yīng)用與發(fā)展[J];分子診斷與治療雜志;2013年01期

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本文編號：1735802