本文選題：脊髓損傷(SCI)　切入點(diǎn)：上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP)　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：[目的]觀察在體外共培養(yǎng)并且接受980nm近紅外線照射后,上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs-PEG-M540)對幼年Sprague Dawley (SD)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的殺傷作用。探討UCNPs介導(dǎo)的光動力療法在促進(jìn)大鼠脊髓損傷后減少損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕的形成和行為功能恢復(fù)方面所起的作用。 [方法]采用溶劑熱法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4,UCNPs),并用鍵聯(lián)的方法在顆粒表面包裹聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)和部花青M540(Merocyanine540)。顆粒(NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4-PEG-M540, UCNPs-PEG-M540)在體外被波長980nm的近紅外線激光照射后,用二苯基異苯并呋喃(Diphenylisobenzofuran, DPBF)檢測是否有單線態(tài)氧(singlet oxygen,1O2)的產(chǎn)生。取實(shí)驗(yàn)用幼年SD鼠2只,麻醉后取出脊髓組織并剪碎,置入裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),采用差速黏附和恒溫?fù)u床震搖法對細(xì)胞進(jìn)行純化。細(xì)胞在體外增殖,傳代后,對其用GFAP免疫組化染色進(jìn)行鑒定,并觀察生長狀況。傳至第2代后,將星形膠質(zhì)細(xì)胞收集并與顆粒共培養(yǎng)24小時,用波長980nm的近紅外線激光照射后,MTT觀察細(xì)胞存活情況。并用電鏡觀察細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的變化。與此同時,用NYU Impactor-II打擊器制作Sprague Dawley大鼠胸10脊髓損傷模型(打擊重量和高度為：10g×50mm)。將80只脊髓損傷大鼠隨機(jī)分成4組：DMEM移植組；M540移植組：UCNPs-PEG移植組；UCNPs-PEG-M540移植組。大鼠脊髓損傷1周后,將上述4種移植物分別移植到4組大鼠脊髓損傷區(qū)周圍。術(shù)后采用BBB評分對大鼠的行為功能恢復(fù)情況進(jìn)行評價。12周后,從每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行10%BDA順行示蹤標(biāo)記。標(biāo)記兩周后處死動物,將損傷段脊髓取出作5μm快速冰凍切片后,進(jìn)行BDA顯影,GFAP和NF200免疫組化染色。BWestern blot定量分析GFAP在脊髓損傷區(qū)的表達(dá)。圖片用image pro plus5.0和ImageJ軟件處理,根據(jù)陽性反應(yīng)的積分光密度值(IOD)進(jìn)行組間比較。 [結(jié)果]透射電子顯微鏡(TEM)顯示制備出的顆粒裸核NaYF4:Yb3+,Er3+基本呈六角狀,且粒徑比較均勻,通過粒度分析儀檢測,結(jié)果顯示顆粒直徑在28nm左右。包殼后納米顆粒的形狀仍為六角狀,納米晶的平均尺寸為43nm。X-射線衍射(XRD)分析顯示,包殼后納米顆粒的衍射圖譜與包殼前幾乎一致。裸核及核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒XRD圖均與標(biāo)準(zhǔn)的六角相納米顆粒NaYF4的衍射譜衍射峰的峰位吻合的很好,這說明本實(shí)驗(yàn)所制備出來的裸核顆粒及核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒均是純的六角相的納米顆粒。傅立葉紅外光譜證明在顆粒NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4的表面成功的包覆上了PEG。能量色散X射線光譜分析(Energy Dispersive X-Ray spectrometry, EDX)證明M540被成功的連接到顆粒表面。DPBF在410nm處的吸光度明顯減低,說明經(jīng)近紅外線激發(fā)后,UCNPs-PEG-M540使周圍的溶液中產(chǎn)生了單態(tài)氧。從幼鼠脊髓分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)純化后可以在體外穩(wěn)定的傳4代以上,純度為94.78%,形態(tài)類似成纖維細(xì)胞,GFAP染色呈陽性,細(xì)胞倍增時間約為2-3天。細(xì)胞與顆粒共培養(yǎng),并經(jīng)980nm近紅外光照射后,MTT顯示細(xì)胞存活率明顯下降。電鏡觀察顯示顆粒被細(xì)胞攝取,細(xì)胞膜皺縮,細(xì)胞核發(fā)生碎裂、溶解現(xiàn)象,線粒體溶解,核漿比例失調(diào)。細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡或者壞死表現(xiàn)。將4種移植物分別移植到大鼠脊髓損傷區(qū)周圍后4周開始,UCNPs-PEG-M540移植組動物的BBB評分顯著高于其余3組(p0.05)。BDA順行示蹤標(biāo)記顯示UCNPs-PEG-M540移植組較其余三組有較多的再生神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)。在橫斷面上,UCNPs-PEG-M540移植組陽性反應(yīng)區(qū)域的IOD值顯著高于其余三組(p0.05)。NF200染色結(jié)果表明,UCNPs-PEG-M540移植組陽性反應(yīng)面積的IOD值顯著高于其余三組(p0.05)。而GFAP染色結(jié)果表明,UCNPs-PEG-M540移植組陽性反應(yīng)面積的IOD值顯著低于其余三組(p0.05)。(?)Vestern Blot結(jié)果顯示,GFAP的灰度值在UCNP-PEG-M540移植組的脊髓損傷區(qū)周圍最少(F值=2.17,P0.01),說明膠質(zhì)瘢痕的形成在UCNP-PEG-M540移植組最少。 [結(jié)論]在980nm近紅外光的激發(fā)下,上轉(zhuǎn)換納米顆粒UCNPs-PEG-M540可以有效的殺傷與其共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,可以有效的減少大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成,并且促進(jìn)軸突的再生和大鼠行為功能的恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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