本文選題：易損板塊　切入點(diǎn)：親環(huán)素A　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：人類在冠心病的診治方面已獲得了許多重大進(jìn)展,但在世界范圍內(nèi)其致死率及致殘率仍極高,特別是急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS),仍然是目前威脅人類健康的重要?dú)⑹帧?dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)作為冠心病的主要病理生理基礎(chǔ),其成因極為復(fù)雜,和遺傳及高脂血癥、吸煙、糖尿病、年齡等危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。AS對(duì)人類健康的嚴(yán)重危害激起人們極大的努力去探索其發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制,以求尋找到較好的治療方法。目前對(duì)AS病變進(jìn)展的認(rèn)識(shí)主要來自各種形式的研究,包括人體病理解剖、以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)的細(xì)胞生物學(xué)研究。對(duì)于AS的發(fā)病機(jī)制,目前有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說、血栓形成學(xué)說、平滑肌克隆學(xué)說等。近年來多數(shù)學(xué)者支持“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”,認(rèn)為AS是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞受損后的一種慢性反應(yīng),在此過程中,氧化修飾的脂蛋白、單核源性巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等與動(dòng)脈壁的正常存在成分相互作用促進(jìn)了病變的發(fā)展。內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說的核心理念包括：①內(nèi)皮細(xì)胞的慢性損傷,可伴有功能障礙,引起血管通透性增加、單核細(xì)胞等黏附以及血栓的形成；②富含膽固醇的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)在血管壁中逐漸蓄積；③脂蛋白的氧化修飾(比如LDL轉(zhuǎn)化為ox-LDL)更加促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展；④血液中單核細(xì)胞遷入內(nèi)膜,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞；⑤血小板的黏附；⑥激活的細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)釋放多種因子；⑦內(nèi)膜中的平滑肌細(xì)胞增生,蛋白聚糖及膠原等蓄積；⑧細(xì)胞內(nèi)外脂質(zhì)的蓄積。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征的發(fā)生與斑塊破裂或侵蝕繼發(fā)血栓形成,管腔嚴(yán)重狹窄甚至閉塞,從而導(dǎo)致出現(xiàn)急性心肌缺血有關(guān)。這類發(fā)病人群的病理學(xué)切片顯示斑塊一般具有巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)、薄的纖維帽和斑塊內(nèi)出血等特征,并從臨床實(shí)踐中得到了證實(shí)。為了描述具有破裂傾向的非阻塞性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,Muller等于1989年提出了“易損斑塊”(vulnerable plaque,VP)的概念,指出此類斑塊通常具有較大的脂質(zhì)核心、薄纖維帽,并且斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著研究成果的積累,易損斑塊的概念逐漸為學(xué)者們所認(rèn)可,此類斑塊由于纖維帽較薄,脂質(zhì)核心大,在切應(yīng)力及理化因素的影響下,易出現(xiàn)破裂,破裂后斑塊內(nèi)成分暴露于血液中,易誘發(fā)局部血栓形成,造成管腔狹窄嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)急性閉塞,導(dǎo)致血供心肌組織的缺血壞死,增加臨床急性心血管事件的發(fā)生。從我們目前的認(rèn)識(shí)上來看,充分研究易損斑塊可為我們臨床治療提供重要線索,比如何種方法或藥物可以用于穩(wěn)定斑塊的治療等。許多動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型包括經(jīng)典的主動(dòng)脈球囊拉傷+高脂飲食、單純高脂飲食、免疫損傷+高脂飲食、基因敲除小鼠模型等,都為我們深入地認(rèn)識(shí)和了解動(dòng)脈粥樣硬化斑塊提供了很好的平臺(tái),但上述造模方法均不同程度存在操作困難、斑塊形態(tài)與人類存在差異、價(jià)格昂貴等限制因素,所以我們需要建立一種簡(jiǎn)單易行且形成過程人類相似的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。基于內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說,我們嘗試著利用恒定溫度的低溫氣體損傷血管內(nèi)皮,結(jié)合高脂飲食,盡可能地模擬人類斑塊的發(fā)生發(fā)展,建立一種兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的動(dòng)物模型,為研究提供一個(gè)更好的平臺(tái)。 CD147分子又名基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN),是一種廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白,最初是學(xué)者在研究肺癌中發(fā)現(xiàn),屬于免疫球蛋白超家族的成員。CD147是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的上游調(diào)控因子,能夠誘導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等過度表達(dá)的CD147可刺激MMPs過量產(chǎn)生,細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡,削弱了斑塊纖維帽強(qiáng)度,使斑塊易于破裂,在易損斑塊的發(fā)生及破裂中有重要作用。而親環(huán)素A(Cyclophilin A, CyPA)作為一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的分泌因子,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞／單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞等有潛在的趨化作用。Peter Seizer等在研究CD34+組細(xì)胞分化進(jìn)展為泡沫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CD147/MT1-MMP/MMP-9表達(dá)水平上調(diào),CyPA釋放到上清液中促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotease9, MMP-9)的分泌,CyPA抑制劑可減少細(xì)胞分化過程中MMP-9表達(dá),提示CyPA對(duì)MMP-9的表達(dá)存在一定的調(diào)控。內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)均可表達(dá)CD147和CyPA,二者可能存在相互作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ERK和核因子-KB信號(hào)途徑激活導(dǎo)致MMP-9表達(dá)水平上升。MMPs特別是MMP-9可降解膠原蛋白和彈力蛋白,削弱斑塊纖維帽,增加AS斑塊不穩(wěn)定性。 本研究在完成造模的基礎(chǔ)上,對(duì)斑塊內(nèi)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,探討溫控氣體損傷+高脂飲食建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的可行性；并利用免疫組織化學(xué)染色分析CD147、CyPA、MMP-2、MMP-9在斑塊中表達(dá)的分布特點(diǎn)；同時(shí)利用ShRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染分離提取的兔外周血單核/巨噬細(xì)胞,通過封閉其CD147表達(dá)來觀察CD147-CyPA在MMP-9產(chǎn)生及CyPA誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞趨化過程中是否存在相互作用。 目的 1、利用持續(xù)恒定低溫氣體損傷內(nèi)皮,結(jié)合高脂飲食建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊動(dòng)物模型,探討其可行性。 2、分析動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊結(jié)構(gòu)形態(tài)及CD147、CyPA、MMP-2、MMP-9分布表達(dá)特點(diǎn)及血清學(xué)指標(biāo)變化。 3、利用ShRNA'慢病毒載體轉(zhuǎn)染單核/巨噬細(xì)胞,通過封閉CD147來觀察CD147-CyPA在MMP-9產(chǎn)生及CyPA誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞趨化過程中是否存在相互作用。 方法 1、動(dòng)物模型的建立：健康純種雄性新西蘭白兔24只,按簡(jiǎn)單隨機(jī)方法分為3組,分別為：A組為空白對(duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)；B組為假手術(shù)組：?jiǎn)渭兪中g(shù)損傷操作+高脂飼料喂養(yǎng)；C組為溫控氣體損傷組：低溫氣體損傷+高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料喂養(yǎng)7天后,對(duì)C組利用低溫氣體輸出裝置對(duì)右頸動(dòng)脈內(nèi)膜進(jìn)行損傷,B組給予單純手術(shù)操作,不損傷內(nèi)膜,術(shù)后B組和C組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周,A組始終普通飲食。 2、血清學(xué)指標(biāo)：分別于高脂飲食前、高脂飲食13周(實(shí)驗(yàn)結(jié)束前),通過兔耳中動(dòng)脈采集外周血,利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組血脂、CRP、基質(zhì)金屬蛋白酶9、CD147、CyPA等水平。 3、病理組織學(xué)切片：14周時(shí)處死所有動(dòng)物,留取石蠟包埋切片及冰凍切片,作HE染色、Masson三色染色、彈力纖維染色及油紅0染色；應(yīng)用RAM11、CD147、 CyPA、MMP-2、MMP-9等單克隆抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 4、根據(jù)兔源CD147mRNA的序列構(gòu)建能高效抑制兔外周血單核/巨噬細(xì)胞CD147表達(dá)的shRNA慢病毒載體,將實(shí)驗(yàn)前分離提取的兔外周單核/巨噬細(xì)胞分為空白對(duì)照組、NC對(duì)照組、CD147慢病毒組。對(duì)NC對(duì)照組及CD147慢病毒組分別給予空白慢病毒、CD147-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染,以熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果,并檢測(cè)CD147mRNA及CD147蛋白水平,采用微孔小室趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CyPA對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的趨化作用。對(duì)三組單核/巨噬細(xì)胞分別加入CyPA,孵育24h后ELISA檢測(cè)上清液中MMP-9含量。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)總體比較采用One-way ANOVA.方差齊時(shí)多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)。方差不齊時(shí)樣本均數(shù)間的多重比較采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。兩配對(duì)樣本均數(shù)總體比較時(shí)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。認(rèn)為P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、兔總體生長(zhǎng)良好。C組1只新西蘭白兔因麻醉過量死亡,B組一只因腹瀉死亡,其余動(dòng)物全部完成實(shí)驗(yàn),所得22只動(dòng)物數(shù)據(jù)參與分析。A組8只,B組7只,C組7只。 2、本研究所建立的兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊符合進(jìn)展期病變特點(diǎn),纖維帽薄,膠原纖維少,主要為內(nèi)皮細(xì)胞及薄層平滑肌細(xì)胞組成,內(nèi)膜底部存在散在的脂質(zhì),部分形成脂質(zhì)池,脂質(zhì)池與內(nèi)皮之間被巨噬細(xì)胞及各種來源的泡沫細(xì)胞所浸潤(rùn),部分斑塊纖維帽局部可見裂隙,存在散在小血栓形成,證實(shí)本模型與人類易損斑塊相仿。 3、斑塊分析發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)存在大量巨噬細(xì)胞,是炎癥活躍的主要標(biāo)志。外膜中可見新生微血管,為炎癥細(xì)胞進(jìn)入斑塊提供了一條途徑。其次纖維帽較薄,為單層內(nèi)皮細(xì)胞及少量平滑肌細(xì)胞構(gòu)成,Masson三色染色顯示纖維帽內(nèi)膠原纖維缺乏,特別是正常血管壁組織和斑塊交界處、斑塊轉(zhuǎn)角處纖維帽最薄。斑塊內(nèi)存在大的脂質(zhì)核心,但無膽固醇結(jié)晶等,這與造模高脂飲食周期較短有關(guān),且斑塊內(nèi)存在較嚴(yán)重的的粘液樣變,使斑塊膨脹,增加了斑塊的不穩(wěn)定性。第三,部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落,表現(xiàn)為表面侵蝕,可見散在的纖維蛋白聚集,包裹有紅細(xì)胞、血小板。第四,從HE染色即可看到部分斑塊存在裂隙,延伸到斑塊深處,局部纖維帽缺損,聚集小量血小板、紅細(xì)胞、纖維蛋白。第五,嚴(yán)重狹窄病變,此類模型我們考慮與低溫氣體不但但損傷到了內(nèi)皮,包括血管中膜平滑肌等深層組織。 4、免疫組化分析 空白對(duì)照組：血管結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)膜大部分未見巨噬細(xì)胞,部分可見散在巨噬細(xì)胞,有少量均勻分布的CyPA及CD147表達(dá),未見明顯MMP-2/MMP-9表達(dá)；中膜無巨噬細(xì)胞,未見CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9表達(dá)。 假手術(shù)組：無斑塊存在的血管免疫組化與空白對(duì)照組相仿；形成的斑塊形態(tài)較小,為脂紋期改變,斑塊內(nèi)富含巨噬細(xì)胞,CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9散在表達(dá)；中膜偶有巨噬細(xì)胞表達(dá)于內(nèi)彈力板外側(cè),伴平滑肌排列紊亂。 溫控氣體損傷組：斑塊內(nèi)富含巨噬細(xì)胞及巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞,CD147與CyPA呈帶狀分布表達(dá),且具有共區(qū)域性,MMP-9與MMP-2在整個(gè)斑塊內(nèi)均有分散表達(dá),斑塊靠近管腔處表達(dá)較多,部分彈力板破裂、溶解,中膜平滑肌細(xì)胞與斑塊內(nèi)成分融合,巨噬細(xì)胞表達(dá)豐富,亦可見CD147、CyPA、MMP-9、MMP-2等表達(dá),無明顯規(guī)律。 5、血清學(xué)指標(biāo) 血清MMP-9檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)前,三組兔血清MMP-9水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對(duì)照組血清MMP-9水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,無顯著性差異(P0.05)；假手術(shù)組組和溫控氣體損傷組血清MMP-9水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為其MMP-9較實(shí)驗(yàn)前分別明顯升高。假手術(shù)組和溫控氣體損傷組間MMP-9水平有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為后者M(jìn)MP-9水平明顯高于前者。 血清CRP檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)前,三組兔血清CRP水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對(duì)照組血清CRP水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,無顯著性差異(P0.05)；高脂飼料組和低溫氣體損傷+高脂飲食組血清CRP水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為其CRP較實(shí)驗(yàn)前分別明顯升高。高脂飲食組和恒溫氣體損傷+高脂飲食組間CRP水平有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為后者CRP水平明顯高于前者。 血清CD147檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)前,三組兔血清CD147水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對(duì)照組血清CD147水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,無顯著性差異(P0.05)；高脂飼料組與同組實(shí)驗(yàn)前相比略有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而低溫氣體損傷+高脂飲食組血清CD147水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為其CD147較實(shí)驗(yàn)前分別明顯升高。高脂飲食組和恒溫氣體損傷+高脂飲食組間CD147水平有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為后者CD147水平明顯高于前者。 血清CyPA檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)前,三組兔血清CyPA水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對(duì)照組血清CyPA水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,無顯著性差異(P0.05)；高脂飼料組與同組實(shí)驗(yàn)前相比略有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而低溫氣體損傷+高脂飲食組血清CyPA水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比,有顯著性差異(P0.05),表現(xiàn)為其CyPA較實(shí)驗(yàn)前分別明顯升高。高脂飲食組和恒溫氣體損傷+高脂飲食組間CyPA水平有顯著性差異(PO.05),表現(xiàn)為后者CyPA水平明顯高于前者。血脂變化：TC、TG、LDL等指標(biāo)B組與C組13周末較高脂飲食前相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),空白對(duì)照組前后對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6、CD147慢病毒組單核/巨噬細(xì)胞CD147表達(dá)水平較其他兩組明顯降低(P0.01),基因沉默CD147降低了CyPA對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的趨化作用(P0.05)及CyPA誘導(dǎo)的MMP-9(P0.05)產(chǎn)生。 結(jié)論 1.我們采用的恒溫氣體連續(xù)刺激損傷內(nèi)皮結(jié)合高脂飲食的方法可有效建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊,形態(tài)分析符合進(jìn)展性動(dòng)脈粥樣硬化病變,與人類易損斑塊相仿。 2.易損斑塊內(nèi)CD147與CyPA分布具有共區(qū)域性,CyPA可能在MMPs產(chǎn)生中起到促進(jìn)作用；在易損斑塊中可見大量巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞聚集,MMP-9與MMP-2表達(dá)明顯增多。 3. CyPA對(duì)單核／巨噬細(xì)胞趨化作用依賴或部分依賴于膜CD147水平,阻斷CyPA-CD147相互作用可顯著降低單核／巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1700213