本文選題：易損板塊　切入點：親環(huán)素A　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：人類在冠心病的診治方面已獲得了許多重大進展,但在世界范圍內其致死率及致殘率仍極高,特別是急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS),仍然是目前威脅人類健康的重要殺手。動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)作為冠心病的主要病理生理基礎,其成因極為復雜,和遺傳及高脂血癥、吸煙、糖尿病、年齡等危險因素密切相關。AS對人類健康的嚴重危害激起人們極大的努力去探索其發(fā)病及進展機制,以求尋找到較好的治療方法。目前對AS病變進展的認識主要來自各種形式的研究,包括人體病理解剖、以動物模型為基礎的細胞生物學研究。對于AS的發(fā)病機制,目前有脂質浸潤學說、血栓形成學說、平滑肌克隆學說等。近年來多數學者支持“內皮損傷反應學說”,認為AS是對內皮細胞受損后的一種慢性反應,在此過程中,氧化修飾的脂蛋白、單核源性巨噬細胞、T淋巴細胞等與動脈壁的正常存在成分相互作用促進了病變的發(fā)展。內皮損傷反應學說的核心理念包括：①內皮細胞的慢性損傷,可伴有功能障礙,引起血管通透性增加、單核細胞等黏附以及血栓的形成；②富含膽固醇的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)在血管壁中逐漸蓄積；③脂蛋白的氧化修飾(比如LDL轉化為ox-LDL)更加促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展；④血液中單核細胞遷入內膜,進一步轉化為巨噬細胞和泡沫細胞；⑤血小板的黏附；⑥激活的細胞(如巨噬細胞、平滑肌細胞等)釋放多種因子；⑦內膜中的平滑肌細胞增生,蛋白聚糖及膠原等蓄積；⑧細胞內外脂質的蓄積。組織學研究發(fā)現急性冠脈綜合征的發(fā)生與斑塊破裂或侵蝕繼發(fā)血栓形成,管腔嚴重狹窄甚至閉塞,從而導致出現急性心肌缺血有關。這類發(fā)病人群的病理學切片顯示斑塊一般具有巨噬細胞源性泡沫細胞浸潤、薄的纖維帽和斑塊內出血等特征,并從臨床實踐中得到了證實。為了描述具有破裂傾向的非阻塞性動脈粥樣硬化斑塊,Muller等于1989年提出了“易損斑塊”(vulnerable plaque,VP)的概念,指出此類斑塊通常具有較大的脂質核心、薄纖維帽,并且斑塊內巨噬細胞浸潤。隨著研究成果的積累,易損斑塊的概念逐漸為學者們所認可,此類斑塊由于纖維帽較薄,脂質核心大,在切應力及理化因素的影響下,易出現破裂,破裂后斑塊內成分暴露于血液中,易誘發(fā)局部血栓形成,造成管腔狹窄嚴重時可出現急性閉塞,導致血供心肌組織的缺血壞死,增加臨床急性心血管事件的發(fā)生。從我們目前的認識上來看,充分研究易損斑塊可為我們臨床治療提供重要線索,比如何種方法或藥物可以用于穩(wěn)定斑塊的治療等。許多動脈粥樣硬化斑塊模型包括經典的主動脈球囊拉傷+高脂飲食、單純高脂飲食、免疫損傷+高脂飲食、基因敲除小鼠模型等,都為我們深入地認識和了解動脈粥樣硬化斑塊提供了很好的平臺,但上述造模方法均不同程度存在操作困難、斑塊形態(tài)與人類存在差異、價格昂貴等限制因素,所以我們需要建立一種簡單易行且形成過程人類相似的實驗性動物模型�；趦绕p傷反應學說,我們嘗試著利用恒定溫度的低溫氣體損傷血管內皮,結合高脂飲食,盡可能地模擬人類斑塊的發(fā)生發(fā)展,建立一種兔頸動脈粥樣硬化易損斑塊的動物模型,為研究提供一個更好的平臺。 CD147分子又名基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN),是一種廣泛表達的跨膜糖蛋白,最初是學者在研究肺癌中發(fā)現,屬于免疫球蛋白超家族的成員。CD147是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的上游調控因子,能夠誘導MMPs的產生。在動脈粥樣硬化斑塊中,巨噬細胞、泡沫細胞、內皮細胞等過度表達的CD147可刺激MMPs過量產生,細胞外基質合成和降解失衡,削弱了斑塊纖維帽強度,使斑塊易于破裂,在易損斑塊的發(fā)生及破裂中有重要作用。而親環(huán)素A(Cyclophilin A, CyPA)作為一種氧化應激誘導的分泌因子,對內皮細胞／單核細胞/中性粒細胞等有潛在的趨化作用。Peter Seizer等在研究CD34+組細胞分化進展為泡沫細胞中發(fā)現CD147/MT1-MMP/MMP-9表達水平上調,CyPA釋放到上清液中促進基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotease9, MMP-9)的分泌,CyPA抑制劑可減少細胞分化過程中MMP-9表達,提示CyPA對MMP-9的表達存在一定的調控。內皮細胞和巨噬細胞表達均可表達CD147和CyPA,二者可能存在相互作用誘導巨噬細胞ERK和核因子-KB信號途徑激活導致MMP-9表達水平上升。MMPs特別是MMP-9可降解膠原蛋白和彈力蛋白,削弱斑塊纖維帽,增加AS斑塊不穩(wěn)定性。 本研究在完成造模的基礎上,對斑塊內結構進行分析,探討溫控氣體損傷+高脂飲食建立兔頸動脈粥樣硬化易損斑塊的可行性；并利用免疫組織化學染色分析CD147、CyPA、MMP-2、MMP-9在斑塊中表達的分布特點；同時利用ShRNA慢病毒載體轉染分離提取的兔外周血單核/巨噬細胞,通過封閉其CD147表達來觀察CD147-CyPA在MMP-9產生及CyPA誘導單核/巨噬細胞趨化過程中是否存在相互作用。 目的 1、利用持續(xù)恒定低溫氣體損傷內皮,結合高脂飲食建立兔頸動脈粥樣硬化易損斑塊動物模型,探討其可行性。 2、分析動脈粥樣硬化易損斑塊結構形態(tài)及CD147、CyPA、MMP-2、MMP-9分布表達特點及血清學指標變化。 3、利用ShRNA'慢病毒載體轉染單核/巨噬細胞,通過封閉CD147來觀察CD147-CyPA在MMP-9產生及CyPA誘導單核/巨噬細胞趨化過程中是否存在相互作用。 方法 1、動物模型的建立：健康純種雄性新西蘭白兔24只,按簡單隨機方法分為3組,分別為：A組為空白對照組：普通飼料喂養(yǎng)；B組為假手術組：單純手術損傷操作+高脂飼料喂養(yǎng)；C組為溫控氣體損傷組：低溫氣體損傷+高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料喂養(yǎng)7天后,對C組利用低溫氣體輸出裝置對右頸動脈內膜進行損傷,B組給予單純手術操作,不損傷內膜,術后B組和C組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周,A組始終普通飲食。 2、血清學指標：分別于高脂飲食前、高脂飲食13周(實驗結束前),通過兔耳中動脈采集外周血,利用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組血脂、CRP、基質金屬蛋白酶9、CD147、CyPA等水平。 3、病理組織學切片：14周時處死所有動物,留取石蠟包埋切片及冰凍切片,作HE染色、Masson三色染色、彈力纖維染色及油紅0染色；應用RAM11、CD147、 CyPA、MMP-2、MMP-9等單克隆抗體對實驗動物血管進行免疫組織化學染色。 4、根據兔源CD147mRNA的序列構建能高效抑制兔外周血單核/巨噬細胞CD147表達的shRNA慢病毒載體,將實驗前分離提取的兔外周單核/巨噬細胞分為空白對照組、NC對照組、CD147慢病毒組。對NC對照組及CD147慢病毒組分別給予空白慢病毒、CD147-shRNA慢病毒轉染,以熒光顯微鏡觀察轉染效果,并檢測CD147mRNA及CD147蛋白水平,采用微孔小室趨化實驗檢測CyPA對單核/巨噬細胞的趨化作用。對三組單核/巨噬細胞分別加入CyPA,孵育24h后ELISA檢測上清液中MMP-9含量。 5、統計學分析：數據應用SPSS13.0軟件進行統計學描述與分析,計量資料用均數±標準差表示。多個樣本均數總體比較采用One-way ANOVA.方差齊時多個樣本均數間的多重比較采用LSD檢驗。方差不齊時樣本均數間的多重比較采用Dunnett'sT3檢驗。兩配對樣本均數總體比較時采用配對樣本t檢驗。認為P0.05為差異有統計學意義。 結果 1、兔總體生長良好。C組1只新西蘭白兔因麻醉過量死亡,B組一只因腹瀉死亡,其余動物全部完成實驗,所得22只動物數據參與分析。A組8只,B組7只,C組7只。 2、本研究所建立的兔頸動脈粥樣硬化易損斑塊符合進展期病變特點,纖維帽薄,膠原纖維少,主要為內皮細胞及薄層平滑肌細胞組成,內膜底部存在散在的脂質,部分形成脂質池,脂質池與內皮之間被巨噬細胞及各種來源的泡沫細胞所浸潤,部分斑塊纖維帽局部可見裂隙,存在散在小血栓形成,證實本模型與人類易損斑塊相仿。 3、斑塊分析發(fā)現斑塊內存在大量巨噬細胞,是炎癥活躍的主要標志。外膜中可見新生微血管,為炎癥細胞進入斑塊提供了一條途徑。其次纖維帽較薄,為單層內皮細胞及少量平滑肌細胞構成,Masson三色染色顯示纖維帽內膠原纖維缺乏,特別是正常血管壁組織和斑塊交界處、斑塊轉角處纖維帽最薄。斑塊內存在大的脂質核心,但無膽固醇結晶等,這與造模高脂飲食周期較短有關,且斑塊內存在較嚴重的的粘液樣變,使斑塊膨脹,增加了斑塊的不穩(wěn)定性。第三,部分內皮細胞脫落,表現為表面侵蝕,可見散在的纖維蛋白聚集,包裹有紅細胞、血小板。第四,從HE染色即可看到部分斑塊存在裂隙,延伸到斑塊深處,局部纖維帽缺損,聚集小量血小板、紅細胞、纖維蛋白。第五,嚴重狹窄病變,此類模型我們考慮與低溫氣體不但但損傷到了內皮,包括血管中膜平滑肌等深層組織。 4、免疫組化分析 空白對照組：血管結構完整,內膜大部分未見巨噬細胞,部分可見散在巨噬細胞,有少量均勻分布的CyPA及CD147表達,未見明顯MMP-2/MMP-9表達；中膜無巨噬細胞,未見CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9表達。 假手術組：無斑塊存在的血管免疫組化與空白對照組相仿；形成的斑塊形態(tài)較小,為脂紋期改變,斑塊內富含巨噬細胞,CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9散在表達；中膜偶有巨噬細胞表達于內彈力板外側,伴平滑肌排列紊亂。 溫控氣體損傷組：斑塊內富含巨噬細胞及巨噬細胞來源的泡沫細胞,CD147與CyPA呈帶狀分布表達,且具有共區(qū)域性,MMP-9與MMP-2在整個斑塊內均有分散表達,斑塊靠近管腔處表達較多,部分彈力板破裂、溶解,中膜平滑肌細胞與斑塊內成分融合,巨噬細胞表達豐富,亦可見CD147、CyPA、MMP-9、MMP-2等表達,無明顯規(guī)律。 5、血清學指標 血清MMP-9檢測結果顯示：實驗前,三組兔血清MMP-9水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對照組血清MMP-9水平與同組實驗前相比,無顯著性差異(P0.05)；假手術組組和溫控氣體損傷組血清MMP-9水平與同組實驗前相比,有顯著性差異(P0.05),表現為其MMP-9較實驗前分別明顯升高。假手術組和溫控氣體損傷組間MMP-9水平有顯著性差異(P0.05),表現為后者MMP-9水平明顯高于前者。 血清CRP檢測結果顯示：實驗前,三組兔血清CRP水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對照組血清CRP水平與同組實驗前相比,無顯著性差異(P0.05)；高脂飼料組和低溫氣體損傷+高脂飲食組血清CRP水平與同組實驗前相比,有顯著性差異(P0.05),表現為其CRP較實驗前分別明顯升高。高脂飲食組和恒溫氣體損傷+高脂飲食組間CRP水平有顯著性差異(P0.05),表現為后者CRP水平明顯高于前者。 血清CD147檢測結果顯示：實驗前,三組兔血清CD147水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對照組血清CD147水平與同組實驗前相比,無顯著性差異(P0.05)；高脂飼料組與同組實驗前相比略有升高,但差異無統計學意義(P0.05),而低溫氣體損傷+高脂飲食組血清CD147水平與同組實驗前相比,有顯著性差異(P0.05),表現為其CD147較實驗前分別明顯升高。高脂飲食組和恒溫氣體損傷+高脂飲食組間CD147水平有顯著性差異(P0.05),表現為后者CD147水平明顯高于前者。 血清CyPA檢測結果顯示：實驗前,三組兔血清CyPA水平無顯著性差異(P0.05),第13周末,空白對照組血清CyPA水平與同組實驗前相比,無顯著性差異(P0.05)；高脂飼料組與同組實驗前相比略有升高,但差異無統計學意義(P0.05),而低溫氣體損傷+高脂飲食組血清CyPA水平與同組實驗前相比,有顯著性差異(P0.05),表現為其CyPA較實驗前分別明顯升高。高脂飲食組和恒溫氣體損傷+高脂飲食組間CyPA水平有顯著性差異(PO.05),表現為后者CyPA水平明顯高于前者。血脂變化：TC、TG、LDL等指標B組與C組13周末較高脂飲食前相比明顯升高,差異有統計學意義(P0.05),空白對照組前后對比差異無統計學意義(P0.05)。 6、CD147慢病毒組單核/巨噬細胞CD147表達水平較其他兩組明顯降低(P0.01),基因沉默CD147降低了CyPA對單核/巨噬細胞的趨化作用(P0.05)及CyPA誘導的MMP-9(P0.05)產生。 結論 1.我們采用的恒溫氣體連續(xù)刺激損傷內皮結合高脂飲食的方法可有效建立兔頸動脈粥樣硬化易損斑塊,形態(tài)分析符合進展性動脈粥樣硬化病變,與人類易損斑塊相仿。 2.易損斑塊內CD147與CyPA分布具有共區(qū)域性,CyPA可能在MMPs產生中起到促進作用；在易損斑塊中可見大量巨噬細胞及泡沫細胞聚集,MMP-9與MMP-2表達明顯增多。 3. CyPA對單核／巨噬細胞趨化作用依賴或部分依賴于膜CD147水平,阻斷CyPA-CD147相互作用可顯著降低單核／巨噬細胞MMP-9表達水平。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5

【參考文獻】

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本文編號：1700213