本文選題：脂肪干細胞(ADSCs)　切入點：myocardin基因　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：[背景和目的] 勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)是指陰莖勃起硬度不足以插入陰道或維持時間不足以圓滿完成性交。最新研究發(fā)現(xiàn),ED的發(fā)病率在不到40歲男性患者為1%-10%、40到49歲為2%-9%、60到69歲為20%-40%,而超過70歲的男人則高達50%-100%。ED是糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者常見的并發(fā)癥,糖尿病是ED最危險的因素,由糖尿病誘發(fā)的ED稱之為糖尿病性勃起功能障礙(diabetes-induced erectile dysfunction, DIED)。目前DIED的治療種類雖多,但均有缺陷,如療程長、療效不確切、費用高昂、尤其是很大一部分DIED患者對一線藥物(5型磷酸二酯酶抑制劑,phosphodiesterasetype5inhibitors,PDE5i)不敏感而又不能或不愿意接受二線(如真空勃起裝置)和三線治療(陰莖假體置入)方案等。因此,探索更理想的方法是DIED臨床治療的迫切需求。 陰莖海綿體平滑肌(Corpus cavernosum smooth muscle, CCSM),作為陰莖海綿體竇狀間隙舒張和陰莖勃起的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),在陰莖勃起過程中對血流動力學改變發(fā)揮重要的作用,任何引起CCSM組織或細胞損傷的因素,均可能導致患者ED的發(fā)生。有學者提出,糖尿病引起的CCSM細胞數(shù)量減少、細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變及細胞舒縮功能受損是導致ED發(fā)生的重要原因。我們也已證實糖尿病性ED大鼠的陰莖海綿體組織及細胞中,平滑肌細胞(SMC, smooth muscle cells)標記物、收縮相關(guān)因子a肌動蛋白(SMa-actin, SMA)、平滑肌細胞肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain, SMMHC)、肌滑蛋白(smoothelin)、堿性調(diào)寧蛋白(calponin)表達明顯下降,CCSM細胞數(shù)量減少及細胞舒縮功能受損。因此,DIED的發(fā)生與CCSM細胞的病理改變和缺失密切相關(guān),目前尚缺乏從根本上改善這些病理狀態(tài)的理想方法。 隨著基因工程技術(shù)和干細胞技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用,給解決這一難題帶來了希望。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)具有自我更新和多向分化潛能,經(jīng)誘導后在體外可分化為多種細胞,取材方便,由脂肪組織提取后增長速度較快,可自體移植。同時,ADSCs具有誘導多向分化性和表觀修飾后能表達特定外源目的基因,其無論在體內(nèi)還是體外都具有很強的可塑性,用誘導分化后的ADSCs來替代病理改變或缺失的細胞,恢復組織和器官的生理功能,達到治療疾病的目的,可行性強,應(yīng)用前景廣闊,被認為是未來再生醫(yī)學中較為理想的種子細胞。Myocardin是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子蛋白,在SMC分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,其調(diào)控SMC分化的機制主要是通過與血清效應(yīng)因子(serum response factor, SRF)結(jié)合而發(fā)揮作用。有學者將Myocardin基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells, BMSCs)注入心肌梗死小鼠模型的梗死部位,發(fā)現(xiàn)Myocardin基因修飾的BMSCs向平滑肌樣細胞分化,同時發(fā)現(xiàn)小鼠左室功能明顯提高。另外,Madonna等人使小鼠ADSCs高表達myocardin A (Myocardin的一個亞型),結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)基因修飾的ADSCs在一定時間內(nèi)會出現(xiàn)肌細胞樣收縮,進一步分析發(fā)現(xiàn)這些細胞均表達SMA。 大量研究發(fā)現(xiàn),基因修飾干細胞治療ED較單純基因治療和干細胞治療更具優(yōu)勢。基因修飾干細胞治療是利用載體將目的基因轉(zhuǎn)移到干細胞內(nèi),使干細胞獲得新的性狀,再通過體內(nèi)回輸而矯正體內(nèi)異常的基因表達和病變細胞,從而達到治療疾病的目的。慢病毒載體由于具有攜帶基因片段容量大,轉(zhuǎn)染效率較高,目的基因可在宿主細胞中長時間穩(wěn)定表達,以及安全性好等諸多優(yōu)點,現(xiàn)己成為轉(zhuǎn)移目的基因的理想載體。因此,我們認為若將myocardin基因修飾后的ADSCs移植到陰莖海綿體內(nèi),通過增加CCSM細胞的數(shù)量及修復其舒縮功能,無疑將會使DIED的治療達到一個新的高度,但目前國內(nèi)外還未見有此方面的報道。本研究從體外探討myocardin基因轉(zhuǎn)染對大鼠ADSCs分化的影響,并對該基因在ADSCs向SMC分化中的作用及其機制進行相關(guān)研究,為進一步研究采用myocardin基因修飾ADSCs移植治療DIED奠定理論基礎(chǔ)。 [方法] 1.大鼠附睪旁ADSCs的體外分離培養(yǎng)及生物學特性研究 在SD大鼠麻醉狀態(tài)下,取其兩側(cè)附睪旁脂肪組織,將其洗凈、剪碎后,使用膠原酶消化貼壁篩選法進行原代培養(yǎng),細胞生長融合至80%左右時進行傳代培養(yǎng)；對ADSCs進行凍存、復蘇實驗；MTT檢測P3、5、7代及凍存復蘇后ADSCs的生長活力,并繪制生長曲線；取P3代和凍存復蘇后的ADSCs,分別行多向分化潛能鑒定和表面分子標記CD29和CD44的鑒定。為本課題組利用ADSCs作為種子細胞治療ED等泌尿男科疾病的研究奠定基礎(chǔ)。 2. Myocardin基因重組慢病毒載體構(gòu)建及其在大鼠ADSCs中的表達 使用全基因合成技術(shù)的方式人工合成大鼠myocardin基因,構(gòu)建其重組慢病毒載體pLVX-IRES-Neo-myocardin,并對其進行酶切鑒定及測序鑒定；提取重組質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo-myocardin,與包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞包裝出含有目的基因myocardin的慢病毒顆粒,同時包裝出空載體病毒顆粒,分別測定其病毒滴度。將大鼠ADSCs分為實驗組(pLVX-IRES-Neo-myocardin+ADSCs),空載對照組(pLVX-IRES-Neo+ADSCs)及空白組(ADSCs),分別用重組慢病毒和空載體病毒感染72h后,采用RT-QPCR和Western blot檢測各組ADSCs中myocardin mRNA和蛋白的表達情況,并進行統(tǒng)計學分析。為應(yīng)用攜帶myocardin基因的ADSCs移植治療糖尿病性ED奠定實驗基礎(chǔ)。 3. Myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用及機制 分別將重組慢病毒顆粒pLVX-IRES-Neo-myocardin和空載體病毒顆粒pLVX-IRES-Neo轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs, G418篩選2周后,使用免疫熒光(IF)檢測轉(zhuǎn)染后細胞中SMA。SMMHC。smoothelin、calponin、myocardin和SRF的表達情況RT-QPCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中SMA、SMMHC、smoothelin和calponin mRNA的表達情況,并行統(tǒng)計學分析；Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞中SMA、SMMHC和myocardin的表達情況,并行統(tǒng)計學分析；Ⅰ型膠原格柵細胞收縮力測定法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的收縮力；免疫共沉淀(IP)檢測轉(zhuǎn)染后細胞中myocardin與SRF之間是否存在相互作用。在體外,從細胞和分子水平探討myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用,并探討其部分機制。為接下來從動物和整體水平,觀察myocardin基因修飾的ADSCs移植,對糖尿病性ED大鼠陰莖勃起功能的影響及其相關(guān)機制的研究提供理論依據(jù)。 [結(jié)果] 1.大鼠附睪旁ADSCs的體外分離培養(yǎng)及生物學特性研究 體外培養(yǎng)的ADSCs易擴增、增殖迅速,.原代細胞呈短梭形或多角形,傳代后以長梭形為主,呈旋渦狀或束狀排列,形態(tài)均一,成纖維樣細胞生長。細胞經(jīng)過多次傳代后仍能保持較強的增值能力,其生長曲線呈“S”形。經(jīng)成脂誘導液培養(yǎng)后,表現(xiàn)出脂肪細胞特性,油紅O染色示胞漿內(nèi)有脂滴出現(xiàn)；經(jīng)成骨誘導液培養(yǎng)后,表現(xiàn)出成骨特性,茜素紅染色出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。流式細胞儀檢測結(jié)果可見ADSCs中CD29和CD44分子陽性率高,CD29陽性率87.2%、CD44陽性率93.5%；ADSCs在液氮中凍存3個月后復蘇,其活力仍保持較好,存活率也較高。 2. Myocardin基因重組慢病毒載體構(gòu)建及其在大鼠ADSCs中的表達 所獲myocardin基因測序證明與Gene Bank中序列一致,重組慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo-myocardin經(jīng)酶切及測序鑒定為正確克隆,并包裝出病毒,其中重組慢病毒的滴度為2.3×109cfu/ml,空載體對照慢病毒的滴度為4.6×109cfu/ml。重組慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs后行RT-QPCR和Western blot檢測,結(jié)果顯示三組細胞均有myocardin mRNA和蛋白的表達,其中,在實驗組myocardin mRNA和蛋白的相對表達水平明顯高于空載對照組和空白組,實驗組與空載對照組和空白組之間存在顯著差異(P0.05),而空載對照組和空白組之間無顯著差異(P0.05)。 3. myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用及機制 IF檢測到經(jīng)myocardin基因修飾的ADSCs較強表達SMC特異性標志蛋白SMa-actin、SMMHC、smoothelin、calponin及myocardin和SRF,空載對照組的表達則較弱；RT-QPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗組與空載對照組中均可檢測到SMa-actin、 SMMHC、smoothelin和calponin mRNA的表達,且在實驗組中SMA、SMMHC、 smoothelin和calponin mRNA的表達水平明顯高于空載對照組,兩組之間均存在顯著差異(P值分別為0.000、0.001、0.000、0.001)；Western Blot結(jié)果也證實,兩組細胞中均可檢測到myocardin、SMa-actin和SMMHC蛋白的表達,且在實驗組中,myocardin、SMa-actin和SMMHC蛋白表達明顯高于空載對照組,兩組之間存在顯著差異(P值均為0.000)。由此提示,myocardin基因可促進ADSCs向SMC分化。細胞收縮力測定結(jié)果得出,在血清及鈣離子運載體Calcium-Ionophore作用下,與空載對照組相比,實驗組細胞收縮力明顯增強(P=0.001)。IP結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗組和空載對照組均可以檢測到myocardin和SRF復合物的形成,但實驗組相互作用明顯更強。 [結(jié)論] 1.使用膠原酶消化貼壁篩選法從大鼠附睪旁脂肪組織分離培養(yǎng)得到的細胞的確為ADSCs,較純,生長速度快,且具有間充質(zhì)干細胞特性,即能黏附到塑料制品上、具有向成骨細胞和脂肪細胞分化的多向分化潛能,并且能表達特殊的干細胞表面抗原。 2.成功構(gòu)建攜帶myocardin基因的重組慢病毒載體pLVX-IRES-Neo-myocardin,該載體得以病毒包裝,并獲得滴度為2.3×109cfu/ml的高感染力病毒。 3.成功實現(xiàn)了外源性基因myocardin在SD大鼠ADSCs中的表達。 4.在體外,myocardin基因可促進ADSCs向SMC分化。 5.經(jīng)myocardin基因修飾后的ADSCs,其收縮力明顯增強。 6. Myocardin與SRF的相互作用在myocardin基因誘導大鼠ADSCs向SMC分化過程中起著重要作用。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R698

【參考文獻】

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1 韋安陽;劉洋;何書華;張濤;吳子云;劉路浩;;糖尿病性大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞凋亡和增殖特征分析[J];南方醫(yī)科大學學報;2012年02期

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本文編號：1695808